HaloTag teknologi er en multifunksjonell teknologi som har vist betydelig suksess i isolering av både små og store proteinkomplekser fra pattedyrceller. Her vi fremheve fordelene med denne teknologien i forhold til eksisterende alternativer og demonstrere sin nytteverdi for å studere mange aspekter av protein funksjon inne eukaryote celler.
Forskning i proteomikk har eksplodert de siste årene med utviklingen innen massespektrometri evner som har ført til karakterisering av mange proteomes, inkludert de fra virus, bakterier og gjær. Til sammenligning, analyse av den menneskelige proteomet henger etter, delvis på grunn av det store antallet av proteiner som må utredes, men også kompleksiteten i nettverk og interaksjoner disse stede. Å spesifikt møte utfordringene i å forstå den menneskelige proteomet, har vi utviklet HaloTag teknologi for protein isolasjon, spesielt sterk for isolering av multiprotein komplekser og tillater mer effektiv fangst av svake eller forbigående interaksjoner og / eller proteiner i lav overflod. HaloTag er en genetisk kodet protein fusion tag, designet for kovalente, bestemt, og rask immobilisering eller merking av proteiner med ulike ligander. Utnytte disse egenskapene, ble en rekke bruksområder for pattedyrceller utviklet til karakterize protein funksjon og her presenterer vi metoder inkludert: protein pull-downs som brukes for oppdagelsen av nye interaksjoner eller funksjonelle analyser, og cellulær lokalisering. Vi finner betydelige fordeler i fart, spesifisitet, og kovalente fangst av fusjonsproteiner til overflater for proteomikk analyser i forhold til andre tradisjonelle ikke-kovalente tilnærminger. Vi viser disse og den brede nytte av teknologien ved hjelp av to viktige epigenetiske proteiner som eksempler, det menneskelige bromodomain protein BRD4, og histondeacetylase HDAC1. Disse eksemplene viser kraften i denne teknologien i muliggjør oppdagelsen av nye interaksjoner og karakter cellulær lokalisering i eukaryoter, som vil sammen videre forståelse av menneskelige funksjonelle proteomikk.
Forståelse av cellulær funksjon, respons på stimuli, og endringer i utvikling og / eller sykdomstilstander er intrikat knyttet til de-konvolusjon av proteomet gjennom disse ulike dynamiske tilstander 1,2. Mye har blitt gjort for å forstå proteomet av lavere organismer, men gitt antall proteiner og alle mulige interaksjoner, har dette vært svært utfordrende i møte den menneskelige proteomet 1,3-7. Fremskritt innen massespektrometri har sterkt aktivert evnen til å gjennomføre disse studiene, og her presenterer vi en ekstra og betydelig fremskritt med utviklingen av HaloTag teknologi for både effektiv fangst av protein komplekser og funksjonell karakterisering av humane proteiner fra pattedyrceller 8-10. Denne teknologien har nylig blitt vist i flere studier for å være en kritisk faktor for oppdagelsen av viktige interaksjoner, noe som åpner for innsikt i romanen protein funksjon og understanding av sykdom 11-13.
Den HaloTag protein fusjon ble opprinnelig utviklet for å løse flere utfordringer av tradisjonelle affinitet koder og antistoffer som nærstående til protein fangst, rensing, og merking 8-10. Innenfor nesten alle metoder for protein fangst og rensing, er det en ikke-kovalent interaksjon trinn som anvendes for anrikning av et bestemt protein 14. Under dette trinn, kan proteinet og / eller kompleks atskille på grunn av diffusjon, særlig hvis prosessen krever timer i stedet for minutter. For å løse dette problem, ble fusjonsproteinet spesifikt konstruert for å hurtig og irreversibelt samhandle med sine ligander, som kan være enten partikler, overflater, eller fluoroforer 9. Derfor når det er bundet til sin ligand, forblir den bundet, noe som er en av de mest differensierende faktor i forhold til andre affinitet koder. Også vist her, er evnenå ta opp forskjellige biologiske spørsmål med en enkelt konstruksjon, noe som er mulig ved å veksle ligander 9 (figur 1). For eksempel, for å avhøre protein-interaksjoner eller funksjon, er overflate-ligander benyttes for fangst av protein eller komplekser (figur 1). I et separat eksperiment, kan den samme fusjonsprotein bli fluorescensmerkede å undersøke cellulær lokalisering, handel, eller protein omsetning (figur 1). Det er viktig å huske på er imidlertid at når en ligand er bundet, enten det er en overflate eller en fluorofor, er irreversible og derfor andre ligander kan da senere bli bundet i det samme eksperimentet.
Analyse av eksisterende teknologier for å kartlegge protein interaksjoner avsløre problemer med å effektivt isolere spesifikke interaksjoner, inkludert de som er mer forbigående eller er i lavere overflod 1,6,7,14,15. Også nyere arbeid av tallrike gruppens viser bekymring for at innenfor tradisjonelle isolasjonsmetoder, spesielt i området av menneskelige proteomikk, er det et betydelig antall protein forurensninger som kan maskere signaler fra sanne interactors i massespektrometri analyse 16. Eiendommene som er utviklet for HaloTag protein og dets co-utviklet harpiks adresse vel disse bekymringene. I kan oppnås protokollen for komplekse nedtrekk (figur 1), binding av komplekser i 15 min, som begge fremmer kompleks-fangst og redusere nivåer av ikke-spesifikk binding 8.. I tillegg er irreversibelt binding muliggjør effektiv fangst av lav overflod proteiner og gir mulighet for bruk av langt færre celler, igjen reduserer bakgrunns 8.. Når fangst av komplekser er etablert, protokollen omfatter milde vaskeforholdene for å opprettholde komplekse integritet. Eluering av fangede komplekser kan utføres av to metoder og velge hvilken metode er diktert av målet for den nedstrøms analysis. Hvis man ønsker å analysere eller oppdage samvirkende proteiner ved Western blot eller massespektrometri, så er det anbefalt å eluere komplekser med denatureringsmidler som SDS eller urea (figur 1). Dette er spesielt fordelaktig for massespektrometri som proteinet opprinnelig smeltet til HaloTag, betegnet agnet protein, vil bli tilbake bundet til harpiksen, og dermed vil ikke dominere populasjon av peptider detektert i massespektrometri. Dette betyr imidlertid også at agnet protein vil sannsynligvis ikke være synlig i analyse ved western blot, en signifikant forskjell sammenlignet med andre ikke-kovalente affinitet purifications eller co-immunoutfellinger. Dersom målet er å rense et kompleks intakt som skal brukes for funksjonelle studier, kan eluering utføres med TEV (Tobacco Etch Virus) protease, som gjenkjenner kognatreseptoren spalting sekvensen kodet mellom fusjonsproteinet og agnet protein (figur 1). These prøvene kan også analyseres ved massespektrometri, men som senere vist, vil de inneholder en betydelig mengde av agn protein som kan forhindre deteksjon av lavere mengder, spesifikke interactors.
Her presenterer vi pulldown og bildebehandling protokoller brukes på to viktige terapeutiske proteiner, den bromodomain protein BRD4 og en histondeacetylase, HDAC1 17. Vi har vist med disse eksempler, interaksjon med forventede partnere som bestemt ved massespektrometri, enzymatisk aktivitet etter kompliserte isolering for HDAC1 og riktig cellulær lokalisering for begge. Sammen utgjør disse resultatene viser det multifunksjonelle natur og styrke av teknologien for karakterisering av eukaryotiske proteininteraksjoner og funksjon.
Presenteres her er to fusjonsproteiner, Halo-BRD4 og Halo-HDAC1, karakterisert eukaryote pattedyrceller for uttrykk, protein kompleks isolasjon og aktivitet, og cellulær lokalisering. I arbeidet gjennom disse forskjellige protokoller, er det flere viktige trinnene for suksess for hvert forsøk. Som tilfellet er med alle fusjonsprotein, et uttrykk nivå og plassering av koden i seg selv kan være kritisk for å opprettholde fysiologi. Det er derfor viktig å tenke på at N-og / eller C-terminal fusjoner må være utformet hvis forkunnskaper eller arbeide med en annen kode ikke har blitt demonstrert for bestemt protein av valget. Når det gjelder ekspresjon, dersom nivået er for høyt, fortynning av DNA kan utføres ved transfeksjon eller bruk av vektorer med svakere promotorer er mulig å oppnå det nivå som er hensiktsmessig. Tidligere arbeid har blitt utført viser effektiv isolering av makromolekylære komplekser på endogent leVels uttrykks 8, slik at arbeid på svært lave nivåer av uttrykk. Hvis det er mulig, vil mobillokaliseringsstudier også være i stand til å gi innsikt med hensyn til den optimale tag plasseringsposisjonen, så vel som relative uttrykk som er nødvendig for riktig fysiologi.
Når fusjonsproteiner som er klare for mater eksperimenter, for å oppnå maksimal suksess med protokollen er det svært viktig å følge de anbefalte tidsrammer i lysis, binding, og vaskeseksjoner, som en av de største fordelene er at hastigheten av komplekset isolert prosess. Hvis noen av disse trinnene er forlenget i tid, slik som er nødvendig for et antistoff-basert fangst-metoden, er det en risiko for kompleks disassociation eller økt ikke-spesifikk binding 8.. Tilsvarende hvis tidene er forkortet under cellulær lyse eller bindende, celler kan ikke være helt lyseres eller effektivt fanget hhv. Hvis antall vasker er Decrlettet eller god blanding av harpiksen forekommer ikke ved de bindende eller vaskinger, så bakgrunnsnivåer av ikke-spesifikke proteiner vil bli økt. Dessuten er meget viktig som relatert til bindingseffektivitet til harpiksen midlene for lysis. Forsøk på å sonicate prøver, fjerne den anbefalte vaskemiddel, legger SDS eller andre sterke vaskemidler, og / eller omfatter protease inhibitor AEBSF vil resultere i redusert eller tap av binding av fusjonsproteiner og deres komplekser til harpiksen.
Eksisterende metoder for komplekse isolasjon fra pattedyrceller og menneske proteomikk analyser sliter med utfordringen om å redusere bakgrunn i analyse av massespektrometri 16. Dette har vært så betydelig at et oppbevaringssted for forurensende proteiner har blitt skapt av en rekke massespektrometri gruppene 16. Bakgrunn i masse-spektrometri materprøver kan defineres som noe som hindrer identifisering avsanne interactors av agnet protein. Som sådan kan bakgrunn oppstå fra forurensende ikke-spesifikke proteiner eller også store konsentrasjoner av agn protein eller antistoff som brukes til å utfelle agn proteiner. Betydelig arbeid ble gjort på å optimalisere både rullegardin protokoll er presentert her, i tillegg til harpiksen for å redusere nivået av de ikke-spesifikke forurensende proteiner i rullegardinprosessen. Dette er tydelig i de sølvplett geler og massespektrometri-analyse av kontrollen (fig. 2). For å møte de høye nivåer av agn protein eller antistoffer som kan være like skadelig som forurensninger og med hvilke andre metoder sliter, er nedtrekk med SDS eluering anbefalt (Protokoll § 2.4). På grunn av den kovalente tilknytning til harpiksen, vil denne prosess lar mesteparten av start fusion protein kovalent bundet til harpiksen. En liten andel av agnet er observert i massespektrometri-analyse, som antaså skje gjennom hydrolyse, men det gjør ikke presentere et problem for påvisning av andre svakere eller forbigående interaksjoner åtte.
Som nevnt i innledningen, har betydelige fremskritt innen proteomikk blitt aktivert av betydelige fremskritt innen massespektrometri 1,7. Derfor er det viktig å fremheve viktige parametre for valg av massespektrometri-analyse for å deconvolute blandingen av proteiner oppnådd i de nedtrekk. Instrumentering må være robust og i stand til rutinemessig og effektivt å analysere prøver som inneholdt en liten mengde protein, ofte mindre enn <1 pg. Nanoskala kromatografi involverer 50-75 mikrometer interne diameter HPLC kolonner med strømningsrater i 100-300 nl / min rekkevidde er vanligvis ansatt for kompatibilitet med de små utvalgsstørrelser og å maksimere følsomheten til massespektrometer. For å maksimere informasjon som erverves i en enkelt analyse stat of the art massespektrometre i stand til å skaffe høy oppløsning masse spektra på en tidsskala kompatibel med nevnte nanoskala separasjoner, ≥ 10 Hz, er typiske verdier. Disse instrumentene har attomolar nivåer av følsomhet og kan rutinemessig skaffe data med sub ppm forløper og produkt ion masse feiltoleranser. Disse kvalitetsparametere tjene til å øke utbyttet av antallet identifiserte proteiner og selvtilliten assosiert med disse identifikasjoner.
Med disse dataene viser vi fysiologisk cellulær lokalisering, riktig protein: protein interaksjoner sammen med potensial for funn av nye interaksjoner, og isolering av aktive komplekser alt ved hjelp av en enkel konstruksjon. Faktisk alternative teknikker kan anvendes for hver av disse forskjellige aspekter, men sannsynligvis ikke for alle 23,24. Med HaloTag teknologi, kan en multifunksjonell tilnærming brukes, fremme proteomics studier og å skaffe en mer fullstendig forståelse av proteinfunksjon i pattedyrceller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, og Dr. Keith Wood for støtte i dette arbeidet, og Dr. James Cali for kritisk lesing av manuskriptet. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, og MU er ansatte i Promega Corporation. MF, RJ, RA, og DA er ansatte i MS Bioworks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |