हम मानव मैक्रोफेज की पीढ़ी के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. बफी कोट डबल घनत्व ढाल centrifugation द्वारा संसाधित कर रहे हैं और अलग monocytes तो Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में मैक्रोफेज के लिए भेदभाव कर रहे हैं. इस बृहतभक्षककोशिका पैदावार अधिकतम और बाद के प्रयोगों के लिए सेल कटाई की सुविधा.
मानव मैक्रोफेज संक्रामक रोगों से कैंसर से लेकर वैकृत प्रक्रियाओं के ढेर में शामिल कर रहे हैं. इस प्रकार वे इन रोगों के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण मुद्रा. इसलिए हम उच्च बृहतभक्षककोशिका पैदावार में जो परिणाम एक भेदभाव प्रक्रिया द्वारा पीछा बफी कोट से मानव monocytes, के अलगाव के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. तकनीक आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों पर ज्यादातर निर्भर करता है और इस प्रकार मानव मैक्रोफेज की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक समय और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है. संक्षेप में, स्वस्थ रक्त दाताओं से बफी कोट परिधीय रक्त से monocytes फसल के लिए एक डबल घनत्व ढाल centrifugation के अधीन हैं. ये monocytes बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम सीएसएफ) की उपस्थिति में fluorinated ईथीलीन Propylene (FEP) Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में तो सुसंस्कृत हैं. विभेदित मैक्रोफेज आसानी से काटा और बाद में अध्ययन और के रूप में कार्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैकहते हैं. गुणवत्ता नियंत्रण और अलगाव और भेदभाव चरणों की मान्यता के लिए महत्वपूर्ण तरीकों प्रोटोकॉल के भीतर प्रकाश डाला जाएगा. संक्षेप में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल नियमित और reproducibly लागत गहन उपकरणों की आवश्यकता के बिना मानव मैक्रोफेज अलग करने के लिए वैज्ञानिकों को सक्षम बनाता है. इसके अलावा, रोग मॉडल murine मैक्रोफेज का उपयोग circumventing एक syngeneic मानव प्रणाली में अध्ययन किया जा सकता है.
मैक्रोफेज – – monocytic वंश और उनके टर्मिनली विभेदित व्युत्पन्न से कोशिकाओं के विकास, ऊतकों की मरम्मत, और प्रतिरक्षा 1 जैसे विभिन्न प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी के लिए अग्रणी, उनके जैविक समारोह के संबंध में एक हड़ताली plasticity दिखा रहे हैं. बाद के उनके phagocytic और सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 2 के बीच चौराहे पर मैक्रोफेज स्थानों जो प्रतिजन पेश की क्षमता की वजह से है. हालांकि, उनकी क्षमता साइटोकिन्स, chemokines, वृद्धि कारक है, और अन्य संकेतन अणुओं छिपाना 1 उनकी प्रतिरक्षा modulatory समारोह augments बल्कि उनके अतिरिक्त कार्यों के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है न केवल. एम 1 और M2 श्रेणियों 3 में हुई है गैर माइक्रोबियल मध्यस्थता की स्थिति के संदर्भ में इन विविध सक्रियण चरणों दर्पण प्रयास करता है. इस वर्गीकरण पूरा नहीं हुआ है, वहीं यह बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान की एक बुनियादी समझ के लिए अनुमति देता है.
इन बहुमुखी क्षमताओं के कारण यह मैक्रोफेज किसी तरह से ऊतक remodeling या सूजन शामिल है कि कई शर्तों के साथ जुड़े रहे हैं कि कोई आश्चर्य के रूप में आता है. हमलावर रोगजनकों 4-6 की मान्यता और निकासी में उनके मौलिक भूमिका के आगे, मैक्रोफेज तेजी atherosclerosis, फाइब्रोसिस, मोटापा, और कैंसर 7-10 में फोकस में आ गए हैं. मानव मैक्रोफेज की पीढ़ी के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि इन विकृतियों को समझने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम पहले 11 में वर्णित के रूप में एक डबल घनत्व ढाल centrifugation तकनीक से स्वस्थ दाताओं की परिधीय रक्त से मानव monocytes के अलगाव पर आधारित एक विधि प्रस्तुत करते हैं. मैक्रोफेज की ओर भेदभाव सुविधाजनक बनाने के लिए, अलग monocytic कोशिकाओं एम सीएसएफ और सामान्य मानव सीरम 12 की कम मात्रा की उपस्थिति में incubated हैं. आगे से निपटने और सेल फसल को कम करने के लिए, भेदभाव गैस पारगम्य FEP में किया जाता हैएक हाइड्रोफोबिक सतह 12-15 के साथ Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग. वे अभी भी या तो एक एम 1 या M2 की तरह फैशन में जवाब देने में सक्षम हैं के रूप में जिसके परिणामस्वरूप आराम मैक्रोफेज assays की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन किया जा सकता है. ऐसे चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) या केन्द्रापसारक धावन (सीसीई) counterflow रूप monocyte अलगाव और बाद में भेदभाव के वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता उपज, लागत, और समय के बारे में कुछ सीमाएं हैं. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल यह विशेष अभिकर्मकों (जैसे, चुंबकीय मोती एमएसीएस) या डिवाइस (जैसे, सीसीई तंत्र) के लिए आवश्यकता के बिना मानक प्रयोगशाला के उपकरण के साथ किए गए और कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है कि हो सकता है लाभ प्रदान करता है.
मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण प्रेरक कोशिकाओं रहे हैं और immunomodulation, प्रतिजन प्रस्तुति और ऊतक homeostasis में महत्वपूर्ण कार्यों प्रदर्शन. कारण उनके उल्लेखनीय plasticity के लिए, वे अपने phenotype के परिवर्तन के साथ विभिन्न उत्तेजनाओं को प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं. बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण मार्कर का केवल 50% के आसपास सीधे मानव 16 को माउस से अनुवाद किया जा सकता दिखा रहा है कि खबरें हैं हालांकि, हालांकि बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण के बारे में डेटा की अब तक एक बहुत, murine प्रणाली में प्राप्त कर रहे हैं. इसलिए, हम महंगी सामग्री, जैसे, एमएसीएस चुंबकीय मोती या एक counterflow केन्द्रापसारक धावन डिवाइस के लिए आवश्यकता के बिना यहां पर्याप्त संख्या और पवित्रता में प्राथमिक मानव मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
हमारे विधि PBMCs से monocytes के अलगाव और FEP में मैक्रोफेज को उनके बाद भेदभाव पर आधारित है कम conce की उपस्थिति में सेल संस्कृति बैग Teflon में लिपटेएम सीएसएफ 11-13 की ntrations. Monocytes उत्तेजना पर, मानव में कम से कम 5 परिधीय रक्त leukocytes के 10% श्रृंगार जबकि वे निवासी ऊतक मैक्रोफेज या वृक्ष के समान कोशिकाओं से 17 अंतर जहां परिधीय साइटों के लिए भर्ती हैं. साइटोकाइन एम सीएसएफ monocyte अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है और मैक्रोफेज 18,19 करने के लिए उनके भेदभाव ड्राइव. अब तक, monocyte भेदभाव के लिए चुने गए हैं जो M-सीएसएफ सांद्रता लेकिन, हमारे प्रोटोकॉल में हम केवल 2.5 एनजी / एमएल 12 के एक मीटर सीएसएफ एकाग्रता के साथ परिपक्व मैक्रोफेज की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने में सक्षम हैं, 100 एनजी / एमएल अप करने के लिए लेकर , 20. इसके अलावा, कोशिकाओं मैक्रोफेज की टुकड़ी और परिभाषित सेल नंबर में उनके बाद बोने की सुविधा जो FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में संवर्धित कर रहे हैं. बैग में कई बार reused किया जा सकता है, यह आगे अलगाव की प्रक्रिया के लिए लागत कम हो जाती है.
इस प्रक्रिया से प्राप्त मैक्रोफेजCD45, CD14, CD11b, CD11c के लिए बेहद सकारात्मक हैं और शुद्ध, परिपक्व मैक्रोफेज 21,22 की आबादी के लिए तर्क है जो mannose रिसेप्टर CD206 की अभिव्यक्ति दिखा. विशेष रूप से उच्च CD14 अभिव्यक्ति एम सीएसएफ 23 की उपस्थिति में भेदभाव मैक्रोफेज के लिए विशिष्ट है. दूसरों को एक तला हुआ अंडा फेनोटाइप प्रदर्शन करते हुए कोशिकाओं के बोने के बाद, वे एक ठेठ धुरी की तरह आकारिकी दिखा कुछ कोशिकाओं के साथ प्लास्टिक की सतहों को एक तेज पालन प्रदर्शित करते हैं. यह अन्य लेखकों 18,22,24 से टिप्पणियों के अनुसार है.
यह एम सीएसएफ की उपस्थिति में monocyte भेदभाव M2-polarized मैक्रोफेज 16,25 की ओर जाता है कि सूचना मिली थी. हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल से अलग मैक्रोफेज जो वे समर्थक की प्रेरण के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अभी भी ट्यूमर कोशिकाओं 26,27 या LPS के लिए जोखिम के साथ ट्यूमर सेल व्युत्पन्न microvesicles और सह संस्कृति के लिए जोखिम सहित उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं ऐसे आईएल रूप में 1 और भड़काऊ जीन# 946 ;, TNFα, Wnt5a, या एम 1-polarized मैक्रोफेज 3,5,28 के लिए विशिष्ट माना जाता है जो विभिन्न मैट्रिक्स metalloproteinases.
अंत में, तकनीकी रूप से कठिन या महंगा प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना डबल घनत्व ढाल centrifugation और मैक्रोफेज की उच्च संख्या में FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग परिणामों में मैक्रोफेज की ओर बाद में भेदभाव से monocytes का अलगाव. प्राप्त मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति को LPS के माध्यम से शास्त्रीय सक्रियण से लेकर बाद के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों पिछले कुछ वर्षों के दौरान उसे हमेशा उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती Meike Schaffrinski धन्यवाद देना चाहूंगा.
इस काम के संयुक्त अनुसंधान समूह 942 (FOR942) के भीतर जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) के माध्यम से और चिकित्सा के संकाय, जोर्ज-August-विश्वविद्यालय के गौटिंगेन रिसर्च प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित किया गया.
antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |