En mus Model for Patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder

Summary

Dyremodeller har vist sig at være uvurderlige værktøjer i fastlæggelsen vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til udviklingen af ​​kronisk inflammation. Her beskriver vi en musemodel af oral infektion med det humane patogen Porphyromonas gingivalis og detaljeret metoder til at vurdere progressionen af inflammation på lokale og systemiske steder.

Abstract

Kronisk inflammation er en vigtig drivkraft for patologisk vævsskade og en samlende karakteristisk for mange kroniske sygdomme hos mennesker, herunder neoplastisk, autoimmun, og kroniske inflammatoriske sygdomme. Nye beviser implicerer patogen-induceret kronisk inflammation i udviklingen og progressionen af ​​kroniske sygdomme med en bred vifte af kliniske manifestationer. På grund af den komplekse og multifaktoriel ætiologi kronisk sygdom, designe eksperimenter om bevis for kausalitet og etablering af mekanistiske forbindelser er næsten umuligt i mennesker. En fordel ved anvendelse af dyremodeller, er, at både genetiske og miljømæssige faktorer, der kan påvirke forløbet af en bestemt sygdom kan kontrolleres. Således designe relevante dyremodeller for infektion er et afgørende skridt i at identificere vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til kronisk inflammation.

Her beskriver vi en musemodel af patogen-induceret kronisk inflationmmation på lokale og systemiske steder efter infektion med den mundtlige patogen Porphyromonas gingivalis, en bakterie tæt forbundet med human paradentose. Mundtlig infektion af specifik patogen fri mus inducerer en lokal inflammatorisk reaktion resulterer i ødelæggelse af tand støtte alveoleknoglen, et adelsmærke for paradentose. I en etableret musemodel af åreforkalkning, infektion med P. gingivalis accelererer inflammatorisk plak deponering inden aortabihulen og innominate arterie ledsaget af aktivering af det vaskulære endotel, en øget immunrespons celleinfiltrat, og forhøjet ekspression af inflammatoriske mediatorer inden for læsioner. Vi detalje metoder til vurdering af inflammation på lokale og systemiske websteder. Anvendelse af transgene mus og definerede bakterielle mutanter gør denne model særligt velegnet til at identificere både vært og mikrobielle faktorer involveret i initiering, progression, og resultatet af sygdom. Additionally, kan modellen anvendes til at screene for nye terapeutiske strategier, herunder vaccination og farmakologisk intervention.

Introduction

Kronisk inflammation er en vigtig drivkraft for patologisk vævsskade og en samlende karakteristisk for mange kroniske sygdomme hos mennesker. Disse sygdomme inkluderer neoplastiske, autoimmune og kroniske inflammatoriske sygdomme ^1. Ætiologien af ​​mange kroniske sygdomme er stadig uklar, men opfattes som at være kompleks og multifaktoriel, der involverer både genetisk disposition og indførelse af miljømæssige faktorer. Mens perpetuators for inflammation forblive undvigende, de cellulære og molekylære profiler af immunaktivering overlapper betydeligt med disse mønstre observeret i værtens svar på patogener ^2.

Montering dokumentation implicerer infektion med mikrobielle patogener i udviklingen og progressionen af kronisk inflammation og dets forskellige kliniske manifestationer ^2,3. Patogener kan fremkalde og fastholde kronisk betændelse direkte ved at undergrave værtens immunsystem og persistente infektioner <sup> 4. I mangel af mikrobiel vedholdenhed, kan infektion udfælde kronisk betændelse af autoimmune reaktioner udløst af molekylær mimicry til selv-antigener, ændringer i selv-antigener, der gør dem immunogene, eller skader, der frigiver tidligere maskerede vært antigener. Sjældent har dog specifikke patogener blevet identificeret som den universelle årsag til en bestemt kronisk sygdom. Snarere, de fleste af de foreliggende data tyder på, at patogener anvender forskellige mekanismer til at fremkalde kronisk betændelse med et bredt spektrum af kliniske manifestationer og sygdomstilstande resultater i den genetisk modtagelig vært ^3. Således er en detaljeret forståelse af de mekanismer, som specifikke patogener inducerer kronisk betændelse kan få store konsekvenser for den offentlige sundhed, samt behandling og forebyggelse af mange kroniske sygdomme.

Selvom værten og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til induktion og vedligeholdelse af kronisk inflammation erdårligt forstået, fremskridt inden for modellering af patogen-induceret kronisk inflammation er begyndt at fremme vores forståelse af disse processer. P. gingivalis oral infektion model er en unik, velkarakteriseret musemodel af patogen-induceret kronisk betændelse, der tillader analyse af vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til kronisk inflammation på lokalt (oral knogletab) og systemiske steder (åreforkalkning) ^5,6.

P. gingivalis er en Gram-negativ, anaerob oral patogen impliceret i humane periodontal sygdom, en infektion drevet kronisk inflammatorisk sygdom karakteriseret ved ødelæggelse af tand støtte væv ^7. Ud over patologi i den indledende infektionsstedet, akkumulering dokumentation implicerer P. gingivalis -induceret kronisk betændelse i udviklingen og progressionen af systemiske sygdomme, herunder åreforkalkning ^5, en sygdom karakteriseret ved kronisk inflammation af arterielle karvæg. Oral infektion af specifik patogenfri mus med P. gingivalis inducerer en lokal inflammatorisk reaktion, der resulterer i ødelæggelse af tand støtte alveoleknoglen ^8. s gingivalis kan udvindes fra munden af inficerede mus op til 42 dage efter infektion ⁸ og mus udvikle høje niveauer af patogen-specifik serumantistoftitere ^9. I en etableret musemodel af atherosklerose ved anvendelse af apolipoprotein-E ^{– / –} mus (ApoE ^{– / -),} oral infektion med P. gingivalis inducerer kronisk inflammation, der driver inflammatorisk plak deponering inden aortabihulen ¹⁰ og innominate arterie ^11. Progressiv betændelse i innominate arterie af P. gingivalis inficerede mus kan overvåges i levende dyr ved hjælp af in vivo MRI. Histologisk arterielæsioner fra P. gingivalis inficerede mus udviser øget akkumulering af lipider accompasaget ved aktivering af det vaskulære endotel, en øget immunrespons celleinfiltrat, og forhøjet ekspression af inflammatoriske mediatorer ^12. Anvendelse af denne model i knockout-mus har belyst rollen af værten signalsystemer komponenter og inflammatoriske mediatorer, samt celle specifikke interaktioner, der driver s gingivalis induceret immunpatologi ^{12 – 14.} Desuden har forsøg anvender definerede bakterielle mutanter identificeret kritiske P. gingivalis virulensfaktorer bidrager til kronisk inflammation på lokale og systemiske steder ^15.

Denne artikel beskriver metoder til vurdering af P. gingivalis -induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder. Vi giver en detaljeret protokol for analyse af alveoleknogletab ved microCT hjælp Amira software. Desuden definerer vi nytten af serielle in vivo levende dyr MR til vurdering af progressivinflammation i innominate arterie. Vi inkluderer metoder til visualisering og kvantificering af inflammatorisk plak i arterielæsioner, og beskrive deres histologisk karakterisering. Anvendelse af transgene mus og definerede bakterielle mutanter gør denne model særligt velegnet til at identificere både vært og mikrobielle faktorer involveret i initiering, progression, og resultatet af sygdom. Derudover kan modellen anvendes til at screene for nye terapeutiske strategier, herunder vaccination og farmakologisk intervention.

Protocol

1. Vækst og Dyrkning af bakterier Streak frosne lagre af P. gingivalis 381 på anaerobe blodagarplader og inkuberes i 3 – 5 dage i et anaerobt kammer (10% H2 / 10% CO 2/80% N2) ved 37 ° C. Brug plade-dyrket organismer at inokulere 5 ml flydende kulturer af hjerne-hjerte-infusionsvæske (BHI) suppleret med gærekstrakt (0,5%), hemin (10 ug / ml) og menadion (1 ug / ml). Efter O / N-vækst, overføre 5 ml kulturer i 45 ml BHI. Inkubér 50 ml flydende kulturer…

Representative Results

Ved hjælp af passende musemodel og oral infektion regime P. gingivalis inducerer kronisk inflammation og immunpatologi på lokalt (mundhulen) og systemiske sites (arterier) (Figur 1). Hos mus oral infektion med P. gingivalis inducerer en lokal inflammatorisk respons, der driver ødelæggelse af tand støtte alveoleknoglen 8. s gingivalis inficerede mus udvikle serum antistof respons på denne organisme, der er overvejende af IgG-isotype…

Discussion

P. gingivalis oral infektion model giver et værdifuldt redskab til studiet af patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder. Denne unikke model tillader karakterisering af både vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til kronisk inflammation og immunpatologi. Desuden kan modellen anvendes til at screene for nye terapeutiske strategier, herunder immunisering og farmakologisk intervention. De skridt, der er skitseret i denne protokol beskriver den vellykkede brug af denn…

Materials

Name of the Material/Eqiupment	Company	Catalogue Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and Trimethoprim Oral Suspension 200 mg/40 mg per 5ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 Dissecting Scope	Leica
Microm HM 550 Cryostat	Microm