A Mouse Modell for Patogen Utløst kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder

Summary

Dyremodeller har vist seg å være uvurderlig verktøy i å definere vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til utvikling av kronisk betennelse. Her beskriver vi en musemodell for oral infeksjon med humant patogen Porphyromonas gingivalis og detalj metoder for å vurdere utviklingen av betennelse på lokale og systemiske nettsteder.

Abstract

Kronisk betennelse er en viktig driver for patologisk vevsskade og en samlende karakteristikk av mange kroniske sykdommer hos mennesker, inkludert neoplastisk, autoimmune og kroniske inflammatoriske sykdommer. Vekst bevis impliserer patogen-indusert kronisk betennelse i utvikling og progresjon av kroniske sykdommer med en lang rekke kliniske manifestasjoner. På grunn av den komplekse og multifaktorielle etiologi av kronisk sykdom, designe eksperimenter for bevis på kausalitet og etablering av mekanistiske koblinger er nesten umulig i mennesker. En fordel med å bruke dyremodeller er at både genetiske og miljømessige faktorer som kan påvirke løpet av en bestemt sykdom kan kontrolleres. Dermed utforme relevante dyremodeller av infeksjon representerer et viktig steg i å identifisere vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til kronisk betennelse.

Her beskriver vi en musemodell av patogen-indusert kronisk oppblåstmmation på lokale og systemiske nettsteder etter infeksjon med oral patogen Porphyromonas gingivalis, en bakterie nært forbundet med menneskelig periodontal sykdom. Oral infeksjon i spesifikt patogen fri mus induserer en lokal betennelsesreaksjon som fører til ødeleggelse av tann støtte alveolar bein, et kjennetegn på periodontal sykdom. I en etablert musemodell for aterosklerose, infeksjon med P. gingivalis akselererer inflammatorisk plaque-avleiring i aorta sinus og innominate arterie, fulgt av aktivering av det vaskulære endotelium, en økt immuncelle infiltrat og forhøyet ekspresjon av inflammatoriske mediatorer innen lesjoner. Vi detalj metoder for vurdering av betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Bruken av transgene mus og definert bakterie mutanter gjør denne modellen spesielt egnet til å identifisere både vert og mikrobielle faktorer involvert i initiering, progresjon, og resultatet av sykdommen. Additionally, kan modellen brukes til å screene for nye terapeutiske strategier, inkludert vaksinering og farmakologisk intervensjon.

Introduction

Kronisk betennelse er en viktig driver for patologisk vevsskade og en samlende karakteristikk av mange kroniske sykdommer hos mennesker. Disse sykdommene inkluderer neoplastiske, autoimmune og kronisk inflammatoriske sykdommer ^1. Årsakene til mange kroniske sykdommer er fortsatt uklart, men er forstått å være kompleks og multifaktoriell, som involverer både genetisk disposisjon og innføring av miljøfaktorer. Mens perpetuators på betennelse forblir unnvikende, de cellulære og molekylære profiler av immunaktivering lapper betydelig med disse mønstrene observert i verts svar på patogener ^to.

Montering bevis impliserer infeksjon med mikrobielle patogener i utvikling og progresjon av kronisk betennelse og dens mangfoldige kliniske manifestasjoner ^2,3. Patogener kan indusere og opprettholde kronisk betennelse direkte undergraving vertens immunsystemet og etablere vedvarende infeksjoner <sup> 4. I fravær av mikrobiell utholdenhet, kan infeksjon utløse kronisk betennelse fra autoimmune reaksjoner utløst av molekylær mimikk til selv-antigener, endringer i selvantigener som gjør dem immunogenic, eller skader som frigjør tidligere maskerte verts antigener. Sjelden imidlertid ha spesifikke patogener blitt identifisert som den universelle årsaken til en bestemt kronisk sykdom. I stedet foreslår de fleste tilgjengelige data som patogener bruke forskjellige mekanismer for å fremkalle kronisk inflammasjon med et bredt spektrum av kliniske manifestasjoner og sykdoms utfall i genetisk mottakelige verts ^3. Dermed vil en detaljert forståelse av mekanismene hvorved spesifikke patogener indusere kronisk betennelse kan ha vesentlig betydning for folkehelsen, så vel som behandling og forhindring av mange kroniske sykdommer.

Selv om vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til induksjon og vedlikehold av kronisk inflammasjon erdårlig forstått, fremskritt innen modellering av patogen-indusert kronisk betennelse har begynt å videreutvikle vår forståelse av disse prosessene. The P. gingivalis oral smitte modellen er et unikt, godt karakterisert musemodell av patogen-indusert kronisk betennelse som tillater analyse av vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til kronisk betennelse på lokale (oral bentap) og systemiske nettsteder (aterosklerose) ^5,6.

P. gingivalis er en gram-negativ, anaerob patogen oral implisert i human periodontal sykdom, en infeksjon drevet kronisk inflammatorisk sykdom karakterisert ved ødeleggelse av tannstøttevevet ^7.. I tillegg til patologi i den innledende infeksjonsstedet, oppsamling av bevis impliserer P. gingivalis indusert kronisk betennelse i utvikling og progresjon av systemiske sykdommer, inkludert aterosklerose ^5, en sykdom karakterisert ved kronisk inflammation av den arterielle karvegg. Oral infeksjon i spesifikt patogen fri mus med P. gingivalis induserer en lokal betennelsesreaksjon som fører til ødeleggelse av tann støtte alveolar bein ^åtte. P. gingivalis kan utvinnes fra munn av infiserte mus opp til 42 dager etter infeksjon ⁸ og muse utvikle høye nivåer av patogen-spesifikk serum antistofftiter ^ni. I et etablert musemodell av aterosklerose ved hjelp Apolipoprotein-E ^{– / –} mus (ApoE ^{– / -),} oral infeksjon med P. gingivalis induserer kronisk betennelse som driver inflammatorisk avleiring i aorta sinus ¹⁰ og innominate arterie ^11. Progressive betennelse i innominate lunge P. gingivalis -infected mus kan overvåkes i levende dyr ved hjelp av in vivo MR. Histologisk arterielle lesjoner fra P. gingivalis -infected mus utviser økt opphopning av lipider accompalegges ved aktivering av det vaskulære endotelium, en økt immuncelle infiltrat og forhøyet ekspresjon av inflammatoriske mediatorer ^12. Ved å bruke denne modellen i knockout mus har belyst rollen til vertssignalkomponenter og inflammatoriske mediatorer, i tillegg til cellen spesifikke interaksjoner som driver P. gingivalis -indusert immunopathology ^{12 – 14.} I tillegg, har eksperimenter som benytter definerte bakterielle mutanter identifisert kritisk P. gingivalis virulens faktorer som bidrar til kronisk betennelse på lokale og systemiske sider ^15.

Denne artikkelen detaljer metoder for vurdering av P. gingivalis -indusert kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Vi gir en detaljert protokoll for analyse av alveolar bentap ved microCT hjelp Amira programvare. I tillegg definerer vi nytten av serie in vivo levende dyr MR for vurdering av progressiv iflammation innenfor innominate arterien. Vi inkluderer metoder for visualisering og kvantifisering av inflammatorisk plakk i arterielle lesjoner, og beskrive deres histologisk karakterisering. Bruken av transgene mus og definert bakterie mutanter gjør denne modellen spesielt egnet til å identifisere både vert og mikrobielle faktorer involvert i initiering, progresjon, og resultatet av sykdommen. I tillegg kan modellen brukes til å screene for nye terapeutiske strategier, inkludert vaksinering og farmakologisk intervensjon.

Protocol

1. Vekst og dyrking av bakterier Streak frosset bestander av P. gingivalis 381 mot anaerobe blodagarplater og inkuberes i 3 – 5 dager i et anaerobt kammer (10% H 2/10% CO 2/80% N 2) ved 37 ° C. Bruk plate-organismene dyrkes for å inokulere 5 ml væskekulturer av hjerne hjerte infusjonsmedium (BHI) supplert med gjærekstrakt (0,5%), hemin (10 ug / ml), og menadion (1 pg / ml). Etter O / N vekst, overføre de 5 ml kulturer inn i 45 ml BHI. Inkuber …

Representative Results

Bruke riktig musemodell og oral smitte regime, P. gingivalis induserer kronisk betennelse og immunpatologi på lokalt (munnhulen) og systemiske nettsteder (arterier) (figur 1). Hos mus oral infeksjon med P. gingivalis induserer en lokal betennelsesreaksjon som driver ødeleggelse av tann støtte alveolar bein åtte. P. gingivalis -infected mus utvikler serumantistoffresponsen til denne organisme som er hovedsakelig av IgG-isotype 9….

Discussion

The P. gingivalis oral smitte modellen gir et verdifullt verktøy for studier av patogen-indusert kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Denne unike modellen tillater karakterisering av både vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til kronisk betennelse og immunpatologi. I tillegg, kan modellen benyttes for å screene for nye terapeutiske strategier, f.eks immunisering og farmakologisk intervensjon. Trinnene som er beskrevet i denne protokollen beskriver vellykket bruk av denne modell…

Materials

Name of the Material/Eqiupment	Company	Catalogue Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and Trimethoprim Oral Suspension 200 mg/40 mg per 5ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 Dissecting Scope	Leica
Microm HM 550 Cryostat	Microm