Slow-release Drug Delivery gennem Elvax 40W til rotteretina: konsekvenser for behandlingen af ​​kroniske lidelser

Summary

Dette dokument beskriver, hvordan Elvax 40W kan anvendes som en langsom frigivelse fremgangsmåde til afgivelsesenheden til voksne rotter nethinden. Protokollen til fremstilling, påfyldning og levere lægemiddel-harpikskompleks til øjet er beskrevet.

Abstract

Sygdomme i nethinden er vanskelige at behandle, som nethinden ligger dybt i øjet. Invasive metoder til drug delivery er ofte nødvendig for at behandle disse sygdomme. Kroniske retinale sygdomme, såsom retinal ødem eller neovaskularisering normalt kræver flere intraokulære injektioner til effektivt at behandle tilstanden. Men de risici, der er forbundet med disse injektioner øges med gentagen levering af lægemidlet. Derfor skal etableres for at minimere risikoen for reinjektion alternative leveringsmetoder. Flere andre undersøgelser har udviklet metoder til at levere stoffer i længere tid, ved materialer, der kan frigive kemikalier langsomt ind i øjet. I denne undersøgelse, vi skitsere brugen af ​​Elvax 40W, en copolymer harpiks, til at fungere som et redskab for narkotika levering til voksne rotter nethinden. Harpiksen er fremstillet og fyldt med lægemidlet. Lægemiddel-harpikskomplekset derefter implanteres i glaslegemet hulrum, hvor det langsomt vil frigive lægemidlet i løbet af timig. Denne fremgangsmåde blev testet under anvendelse af 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), glutamat analog, der blokerer lyset respons på nethinden. Det blev påvist, at APB langsomt blev frigivet fra harpiksen, og var i stand til at blokere den retinale respons med 7 dage efter implantation. Dette indikerer, at langsom frigivelse afgivelsesenheden ved hjælp af denne copolymerharpiks er effektiv til behandling af retina, og kan anvendes terapeutisk med en yderligere test.

Introduction

Behandlingen af ​​kroniske sygdomme, såsom diabetes og forhøjet blodtryk indebærer mange udfordringer, som disse sygdomme generelt kræve behandling i længere tid, ofte for livet. Dette har givet anledning til udvikling af langsom frigivelse drug delivery-systemer, der mindsker behovet for hyppig dosering. Effektiviteten af ​​disse langsom frigivelse metoder er blevet demonstreret gennem udvikling af insulinpumper, at reducere antallet af insulininjektioner er nødvendige til behandling af diabetes. Kroniske sygdomme i øjet, især dem, der påvirker dens indre lag, kræver hyppig indgivelse af lægemidler gennem invasive procedurer. En sådan kronisk sygdom, der påvirker det menneskelige øje er aldersrelateret maculadegeneration (AMD). Det påvirker den centrale del af nethinden, som er et lag af neuralt væv beliggende på bagsiden af ​​øjet er ansvarlig for at indlede vision. AMD er den førende årsag til blindhed i den vestlige verden ^1. En særlig udfordring med at behandle retinal sygdomme er, at lægemidlet er nødvendig for at nå denne dybe lag i øjet, som ofte kræver invasive metoder til levering. Lægemidler administreres sædvanligvis til det glasagtige kammer og nethinden hjælp intravitreale injektioner. Men med hver injektion er der en risiko for, efter injektion komplikationer, herunder endophthalmitis, nethindeløsning, katarakt og glasagtigt hemorrhaging ^2. Denne risiko multipliceres med hvert reinjektion af lægemidlet.

Reduktion af behovet for flere injektioner ville være en stor fordel i behandlingen af ​​AMD. At behandle den våde form for AMD, hvor ny vækst fartøj er et adelsmærke, den etablerede terapeutiske strategi er at målrette endotel vækstfaktorer (VEGF) ved hjælp af VEGF hæmmere ^3. På nuværende tidspunkt er disse leveres ved gentagne intravitreale injektioner. Tilsvarende behandling af maculaødem, en almindelig komplikation af diabetisk retinopati, kortikosteroider leveret gennem gentagne injektioner <sop> 4. Levering af disse stoffer gennem langsom frigivelse metoderne kan mindske risikoen for efter injektion komplikationer.

Begrebet en langsom frigivelse drug delivery system blev først beskrevet ved anvendelse af en silikonegummi køretøj til at levere små molekyler i dyrevæv ^5. Siden da er der blevet udviklet andre langsom frigivelse metoder til at levere større molekyler, hvoraf flere er blevet testet i øjet. Partikel bærere, såsom bionedbrydelige mikrosfærer, poly-lactid-co-glycolid (PLGA) nanopartikler og phospholipid vesikler (liposomer), kan være nyttige som varevogne ^6,7. PLGA nanopartikler og liposomer er blevet sammenlignet i en in vitro miljø for deres evne til at levere anticancermidler over sclera over tid ^7. Begge køretøjer var effektive langsomt frigive narkotika. Imidlertid blev undersøgelsen kun udført i et in vitro miljø. Bochot et al. (2002) ⁸ testeteffektiviteten af liposomer til at afgive molekyler til nethinden in vivo. De har vist, at liposomer med held levere små oligonukleotider til kanin nethinden. Forfatterne foreslog, at liposomer kunne være gavnlig i behandling af retinale sygdomme ^8. Arten af disse vesikler til at flyde i glaslegemet betyder imidlertid, at de sandsynligvis vil sløre eller hinde ^9.

Okabe et al. (2003) ^10, ikke biologisk nedbrydelig polymer diske består af 33% ethylen-vinylacetat at anvende beta-methasone i kaniner. De implanterede diske i en scleral lomme og demonstreret en effektiv frigivelse af lægemidlet i glaslegemet og retina op til en måned ^10. Men i dette særlige protokol, implantatet var relativt store og stive, og krævede en mere kompleks kirurgisk procedure, herunder en stor sclerale indsnit og suturering.

En tidligere undersøgelse undersøgte tissue reaktion på forskellige polymer køretøjer ved at implantere dem i hornhinden i kaninøjne, og fandt, at ethylen og vinylacetat vasket i alkohol ikke forårsager betændelse eller irritation. Disse komplekser blev vist at opretholde levering af større forbindelser i animalsk væv i længere tid, nogle over op til 100 dage er afhængige af lægemidlet ^11. En sådan type copolymerharpiks er udviklet industrielt i form af Elvax 40W (40 vægt% ethylen-vinylacetat comonomerindhold med en W amidtilsætningsstof at forbedre pellet håndtering). Denne copolymer harpiks er et inert stof, som er stabilt både plads og legemstemperatur. Det har ikke vist sig at forårsage allergi eller toksicitet i biologisk væv. Denne harpiks har faktisk leveres et stort udvalg af stoffer i forskellige eksperimentelle modeller, der undersøger funktionerne af forskellige systemer, såsom bryst-gangsystemet ^12, den primære cortex ^{13,14 <}/ Sup>, og frøen visuelle system ^15. Denne harpiks er også blevet anvendt i øjet til at levere lægemidler til udviklingen skildpadde ^16,17, kyllingefoster ^18,19, og voksen fritte nethinder ^20. Hos rotter centralnervesystemet, har harpiksen kun blevet anvendt i hjernen ^21-23, men dens anvendelse i rotteøjet er ikke blevet dokumenteret.

Fordelene ved denne copolymerharpiks til at levere medikamenter langsomt til nethinden i forhold til andre metoder, er, at det er en stabil forbindelse, der ikke forårsager betændelse eller irritation i øjet. I modsætning partikel bærere vil lægemiddel-harpikskompleks ikke hinde efter implantering, da det sædvanligvis forbliver på stedet for levering i stedet for flydende i glaslegemet. Det ville kun kræve en simpel implantation processen i den glasagtige hulrum tæt limbus af øjet, og ville ikke kræve sutur efter implantation. Der har for nylig været en fremkomst i flere hidtil ukendte leveringssystemer, såsomindkapslet celle teknologi (ECT) ^24,25 hydrogeler ^26, og mikrofilm ^27. Men fremgangsmåden anvendt i den aktuelle undersøgelse til fremstilling og levering af lægemiddel-harpikskompleks er både let at følge og billig, hvilket er mere fordelagtig til anvendelse i et basisk forskningsmiljø. Udfordringen ved at anvende dette kompleks til at levere langsigtede lægemiddelbehandlinger er at bestemme den optimale koncentration af lægemidlet, der vil maksimere de terapeutiske fordele ved at have færre intravitreale injektioner.

Dette papir har til formål at demonstrere anvendelsen af ​​den lægemiddel-harpikskompleks til langtidsbehandling af den voksne rotte nethinden. Effekten af ​​denne leveringsmåde testes ved glutamat analog 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB) som lægemiddel. APB blokerer lyset respons af on bipolære celler ved at efterligne glutamat, et endogent neurotransmitter i nethinden ^28. Når APB konkurrerer med glutamat til dets receptor, det blokerer light svar. APB har været anvendt i fysiologiske studier at kontrollere retinal funktion og måle dens virkning ved hjælp af elektrofysiologiske metoder såsom elektroretinografi (ERG). I tidligere undersøgelser har APB været brugt til både kortsigtet ²⁹ og langtidsbehandling af udviklingen i nethinden; sidstnævnte er involveret give en enkelt dosis via intraokulær injektion dagligt i 30 dage ^30. Den samme mængde APB (0,092 mg i sterilt saltvand, i en koncentration på 50 uM) blev anvendt til alle injektioner som foreslået i tidligere arbejde ^28,29,31. Vi valgte APB at teste lægemiddel-harpiks kompleks som en langsom frigivelse køretøj til at levere lægemidler i øjet. De metoder, der er skitseret i denne undersøgelse svarer til tidligere beskrevne fremgangsmåder, der involverer fremstilling af den lægemiddel-harpiks kompleks ^16,32; Men vi også detaljerede bestemmelser for anvendelsen specifikt i voksne rotter øjet. Efter kirurgisk implantation af APB-loaded harpiks i øjet, blev ERG udført for at fastslå, om APB afskaffer retinal lys reaktion, og derfor hvorvidt APB er lykkedes frigivet i glaslegemet og nethinden.

Protocol

Alle udførte eksperimenter var i overensstemmelse med ARVO Redegørelse for anvendelsen af ​​dyr til øjenlæger og Vision Research, og med godkendelse fra University of L'Aquila Animal Ethics Committee og Australian National University Dyreforsøg Ethics Committee. Voksne rotter (P100-200) blev anvendt i hele denne undersøgelse. 1. Forbered copolymerharpiks Pellets Placer 20 Elvax 40W piller i et lille bægerglas i stinkskab. Fyld bægerglasset med 100% ethano…

Representative Results

Fuld-felt elektroretinografi (ERG) blev anvendt til at påvise virkningen af ​​APB på nethinden. For detaljer om hvordan ERG blev udført, henvises til følgende undersøgelser 33,34. I korte træk, efter at bedøve dyret, blev en guldelektrode placeret på hornhinden af ​​øjet, og henvisningen elektrode blev anbragt i den forreste hovedbunden mellem øjnene, til at optage den elektriske aktivitet af nethinden. Stimuli blev genereret ved hjælp af et elektronisk flashenhed og intensiteten varierede …

Discussion

Dette papir påvises, at anvendelse af et lægemiddel-harpikskompleks til langsom frigivelse levering af lægemidler til nethinden. Vi havde til formål at præsentere en metode, som er relativt billigt og let at anvende i en lille dyremodel.

Eftersom funktionen af ​​APB er at fungere som en glutamat-analog, vil det blokere den retinale respons i øjet. Resultaterne viser, at APB forårsagede blokering af retinale respons med en uge implantation. Dette indikerer, at APB held blev frigive…

Materials

Elvax 40W Pellets	Du Pont, DE, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	A1910
Dichloromethane	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	34856
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
Drierite, calcium sulfate	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	238910
Ketamine, Ilium Ketamil	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Xylazine, Ilium Xylazil-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Atropine Sulphate, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Tetracaine Hydrochloride, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Chloramphenicol, Chlorsig ointment	Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
Pentobarbital, Lethabarb	Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
Lignocaine Hydrochloride, Ilium Lignocaine-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Uni-Core Punch Tool	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Curved Forceps	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Operating Microscope, Zeiss OPMI 99	Zeiss, West Germany
25G Insulin Needle	Terumo Corp., Tokyo, Japan
Dumont Tweezers	World Precision Instruments Inc., FL, USA