Slow-release Drug Delivery gjennom Elvax 40W til Rat Retina: Konsekvenser for behandling av kroniske betingelser

Summary

Dette papir detaljer hvordan Elvax 40W kan brukes som et langsomt frigjørende fremgangsmåte for levering av legemidler til den voksne rotte hinnen. Protokollen for fremstilling, lasting, og avgivelse av medikament-harpikskomplekset til øyet er beskrevet.

Abstract

Sykdommer i retina er vanskelig å behandle som retina ligger dypt inne i øyet. Invasive metoder for levering av legemidler er ofte nødvendig for å behandle disse sykdommene. Kroniske retinale sykdommer slik som retinal neovaskularisering eller ødem krever vanligvis flere intraokulære injeksjoner for effektivt å behandle tilstanden. Men risikoen forbundet med disse injeksjonene øke med gjentatte levering av stoffet. Derfor alternative leveringsmetoder må etableres for å minimere risikoen for reinjeksjon. Flere andre undersøkelser har utviklet metoder for å levere legemidler over lengre tid, gjennom materialer i stand til å slippe kjemikalier langsomt inn i øyet. I denne undersøkelsen har vi skissere bruken av Elvax 40W, en kopolymer harpiks, for å fungere som et redskap for levering av legemidler til voksen rotte netthinnen. Harpiksen er laget og lastet med stoffet. Den stoff-harpiks-komplekset blir deretter implantert inn i glasslegemet, hvor det vil langsomt frigjøre medikamentet i løpet av timeg. Denne metoden ble testet ved anvendelse av 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), en analog glutamat som blokkerer lyset respons av netthinnen. Det ble demonstrert at APB ble langsomt frigjøres fra harpiksen, og var i stand til å blokkere responsen av retinal 7 dager etter implantasjon. Dette indikerer at det langsomt frigjørende levering av legemidler ved hjelp av denne kopolymer-harpiks er effektiv for behandling av retina, og kan anvendes terapeutisk med ytterligere testing.

Introduction

Behandlingen av kroniske sykdommer slik som diabetes og høyt blodtrykk presenterer mange utfordringer, da disse sykdommer generelt krever behandling for lengre perioder, ofte for liv. Dette har kalt for utvikling av langsom frigjøring stoffet leveringssystemer, noe som reduserer behovet for hyppig dosering. Effektiviteten av disse fremgangsmåter med langsom frigivelse er blitt demonstrert gjennom utvikling av insulinpumper, for å redusere antall injeksjoner av insulin som trengs for å behandle diabetes. Kroniske sykdommer i øyet, særlig de som påvirker dens indre lag, krever hyppig administrering av medikamenter gjennom invasive prosedyrer. En slik kronisk sykdom som påvirker det menneskelige øyet er aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Det påvirker det sentrale netthinnen, som er et lag av nervevev ligger på baksiden av øyet er ansvarlig for initiering av syn. AMD er den ledende årsak til blindhet i den vestlige verden ^en. En særlig utfordring med behandling av retinal sykdommer er at stoffet er nødvendig for å nå dette dype lag i øyet, noe som ofte krever invasive metoder for levering. Medikamentene blir vanligvis administrert til glasslegemet og retina kammeret ved hjelp av intravenøse injeksjoner. Imidlertid, for hver injeksjon, er det fare for postinjection komplikasjoner, inkludert endoftalmitt, netthinneavløsning, katarakt og glass blødninger ^2. Denne risikoen er multiplisert med hver reinjeksjon av stoffet.

Å redusere behovet for flere injeksjoner ville være en stor fordel ved behandling av AMD. Å behandle den våte formen for AMD, hvor ny vekst fartøyet er et kjennetegn, er det etablert terapeutisk strategi for å målrette de endoteliale vekstfaktorer (VEGF) ved hjelp av VEGF-hemmere ^tre. I dag er disse levert gjennom gjentatte intravitreale injeksjoner. Tilsvarende, ved behandling av makulær ødem, en vanlig komplikasjon ved diabetisk retinopati, er kortikosteroider leveres gjennom gjentatte injeksjoner <sopp> 4. Levering av disse stoffene gjennom langsom frigivelse metoder kan faktisk redusere risikoen for komplikasjoner postinjection.

Forestillingen om en langsom frigjøring levering av legemidler ble først beskrevet ved hjelp av en silikongummi redskap for å levere små molekyler i animalsk vev ^fem. Siden da har andre langsomme utgivelsen metoder er utviklet for å levere større molekyler, flere av dem har blitt testet i øyet. Partikkel bærere, slik som bionedbrytbare mikrokuler, poly-laktid-ko-glykolid) (PLGA nanopartikler og fosfolipid-vesikler (liposomer) kan være nyttig som leveringskjøretøy ^6,7. PLGA nanopartikler og liposomer har blitt sammenlignet i en in vitro miljø for deres evne til å gi anti-cancer legemidler over sclera over tid ^7.. Begge kjøretøyene var effektive i sakte slippe narkotika. Men studien ble bare utført i en in vitro miljø. Bochot et al. (2002) ⁸ testeteffekten av liposomer for å levere molekyler til netthinnen in vivo. De har vist at liposomer kunne levere små oligonukleotider til kanin retina. Forfatterne foreslo at liposomene kan være fordelaktig i behandling av retinale sykdommer ^8. Men betyr naturen av disse vesikler å flyte i glasslegemet at de vil trolig dimme eller svekke synet ^ni.

Okabe et al. (2003) ¹⁰ benyttet uten biologisk nedbrytbart polymerplater bestående av 33% etylen-vinylacetat å anvende beta-methasone hos kaniner. De implantert plater i en scleral lomme og demonstrerte effektiv frigjøring av stoffet inn i glasslegemet og netthinnen i opptil én måned ^10. Imidlertid, i denne spesielle protokoll, implantatet var forholdsvis stor og stiv, og krevde en mer kompleks kirurgisk prosedyre, inkludert et stort skleral snitt og suturering.

En tidligere studie undersøkte tissue respons på forskjellige polymer kjøretøyer ved å implantere dem inn i hornhinnen i kaninøyne, og funnet at etylen-vinylacetat-kopolymerer vasket i alkohol ikke forårsake inflammasjon eller irritasjon. Disse komplekser ble vist å opprettholde leveringen av større forbindelser i animalsk vev for lengre perioder, noe som overstiger opptil 100 dager avhengig av medikamentet ^11. Én slik type av kopolymer-harpiks har blitt utviklet industrielt i form av Elvax 40W (40 vekt% etylen-vinylacetat-komonomer-innhold med en "W" amid additiv for å forbedre pellet håndtering). Dette kopolymer-harpiks er en inert substans som er stabil ved både romtemperatur og kroppstemperatur. Det har ikke vist seg å forårsake allergi eller forgiftning i biologisk vev. Denne harpiks har effektivt levert et stort utvalg av stoffer i forskjellige eksperimentelle modeller som undersøker de funksjoner av forskjellige systemer, slik som melke duktalt systemet ^12, den primære auditiv cortex ^{13,14 <}/ Sup>, og frosken visuelle systemet ^15. Denne harpiksen har også blitt brukt i øyet for å levere narkotika til å utvikle skilpadde ^16,17, kylling embryo ^18,19, og voksen ilder netthinne ^20. I rotte sentralnervesystemet, har harpiksen bare blitt brukt i hjernen ^21-23, men dens anvendelse i rotte øyet har ikke blitt dokumentert.

Fordelene med å bruke denne kopolymer-harpiks for å levere medikamenter langsomt til netthinnen fremfor andre metoder, er at den er en stabil forbindelse som ikke forårsaker inflammasjon eller irritasjon i øyet. I motsetning til partikkelbærer, vil legemiddel-harpiks-komplekset ikke redusere sikten etter implantering, slik det vanligvis forblir på stedet av leverings istedenfor flytende i glasslegemet. Det ville bare krever en enkel prosess implantering inn i glasslegemet nær limbus av øyet, og ville ikke kreve suturering etter implantasjon. Nylig har det vært en fremvekst i flere nye avgivelsessystemer, f.eksinnkapslet celleteknologi (ECT) ^24,25, Hydrogelene ^26, og mikrofilmer ^27. Men fremgangsmåten anvendt i denne studien for fremstilling og avgivelse av medikament-harpikskomplekset er både lett å følge og billig, for derved å være mer fordelaktig for bruk i en grunnleggende forskning miljø. Utfordringen med å bruke dette komplekset å levere langsiktige medikamentelle behandlinger er å finne den optimale konsentrasjonen av stoffet som vil maksimere de terapeutiske fordelene ved å ha færre intravitreale injeksjoner.

Dette papir har som mål å demonstrere bruken av stoffet-harpiks-komplekset for langtidsbehandling av den voksne rotte hinnen. Effekten av denne modus for levering blir testet ved hjelp av glutamat analoge 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB) som stoffet. APB blokkerer lys respons ved På bipolare celler ved å etterligne glutamat, en endogen neurotransmitter i retina ^28. Når APB konkurrerer med glutamat for sin reseptor, den blokkerer light respons. APB har vært brukt i fysiologiske studier for å kontrollere retinal funksjon og måle dens effekt ved hjelp av elektrofysiologiske metoder som elektroretinografi (ERG). I tidligere studier har APB vært brukt til både kortsiktige ²⁹ og langtidsbehandling av utviklingsnetthinnen; sistnevnte er involvert å gi en enkelt dose via intraokulær injeksjon daglig i 30 dager ^30. Den samme mengde av APB (0,092 mg i sterilt saltvann, ved en konsentrasjon på 50 uM) ble anvendt for alle injeksjoner som foreslått i tidligere arbeid ^28,29,31. Vi valgte APB å teste medikament-harpiks-komplekset som et langsomt frigjørende kjøretøyet for å levere medikamenter inn i øyet. De fremgangsmåter som er skissert i denne undersøkelsen er lik tidligere beskrevne metoder involverer fremstilling av legemiddel-harpiks-komplekset ^16,32; men vi også detalj bruken spesielt i voksen rotte øyet. Etter kirurgisk implantering av APB belastede resin inn i øyet, ble ERG utført for å fastslå om APB opphever retinal lys respons, og derfor om APB har blitt sluppet ut i glasslegemet og netthinnen.

Protocol

Alle eksperimenter utført var i samsvar med ARVO Erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research, og med godkjenning av University of L'Aquila dyreetikk komité og Australian National University forsøk med dyr etikkutvalg. Voksne rotter (P100-200) ble brukt i denne studien. 1. Forbered copolymer Resin Pellets Plasser 20 Elvax 40W pellets inn i en liten glassbeholder i avtrekksskap. Fyll begerglass med 100% etanol sikre å dekke alle pellets. De…

Representative Results

Full-feltet elektroretinografi (ERG) ble brukt til å påvise effekten av APB på netthinnen. For detaljer om hvordan ERG ble utført, kan du se følgende studier 33,34. I korte trekk, etter bedøvelse av dyret, ble en gullelektrode plassert på hornhinnen i øyet, og referanseelektroden ble plassert i fremre hodebunnen mellom øynene, for å registrere den elektriske aktiviteten i netthinnen. Stimuli ble generert ved hjelp av en elektronisk blits og intensiteten varierte fra 10 til 10 juni photois…

Discussion

Dette papir viser at bruk av et medikament-harpikskompleks for det langsomt frigjørende levering av medikamenter til netthinnen. Vi forsøkte å presentere en fremgangsmåte som er relativt billig og lett å anvende i en liten dyremodell.

Gitt at funksjonen av APB er å virke som et glutamat-analog, vil det blokkere retinal respons i øyet. Resultatene viser at APB forårsaket blokkering av retinal respons etter en uke fostertap. Dette indikerer at APB ble vellykket sluppet inn i glasslegem…

Materials

Elvax 40W Pellets	Du Pont, DE, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	A1910
Dichloromethane	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	34856
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
Drierite, calcium sulfate	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	238910
Ketamine, Ilium Ketamil	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Xylazine, Ilium Xylazil-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Atropine Sulphate, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Tetracaine Hydrochloride, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Chloramphenicol, Chlorsig ointment	Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
Pentobarbital, Lethabarb	Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
Lignocaine Hydrochloride, Ilium Lignocaine-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Uni-Core Punch Tool	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Curved Forceps	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Operating Microscope, Zeiss OPMI 99	Zeiss, West Germany
25G Insulin Needle	Terumo Corp., Tokyo, Japan
Dumont Tweezers	World Precision Instruments Inc., FL, USA