Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme
Summary
Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.
Abstract
Ubikitin ve ubikitin benzeri moleküller (ubl'ler) proteinlerin post-translasyonel modifikasyon hipoksi yanıt proteostasis, DNA hasarı tepkisi ve transkripsiyon da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yollar regüle eden bir dinamik bir hücresel sinyal ağı olarak ortaya çıkmaktadır. Daha iyi ubl'ler insan hastalığı ile ilgili yolları düzenleyen nasıl anlamak için, bir insan siRNA'yı derledik "ubiquitome" tüm bilinen ve UBL sistem yolların bileşenlerini tahmin hedefleme 1186 siRNA'nın dubleks havuzlarından oluşan kütüphanesi. Bu kütüphane UBL bileşenler, söz konusu yolun pozitif veya negatif düzenleyici olarak hareket belirlemek için çeşitli biyolojik yolların muhabir ifade eden hücre hatları, bir dizi karşı taranabilir. Burada, bir transkripsiyon tabanlı bir lusiferaz raportör kullanılarak hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin ubiquitome-regülatörleri tanımlamak için bu kütüphane kullanan bir protokol açıklar. Bir ilk tahlil geliştirme aşamasıbirincil, ikincil ve üçüncül / ters evrişim tarama: üç aşamada ekranı gerçekleştirmeden önce hücre çizgisinin, uygun tarama parametrelerini elde etmek için gerçekleştirilir. Sadece araştırmacılar en çok ilgilenen hangi ile yolun üyelerinin raporlama avantajı sunuyor tüm genom SiRNA kütüphaneler üzerine hedeflenmiş kullanımının giderek daha popüler hale gelmektedir. SiRNA tarama doğal kısıtlamalara rağmen, özellikle yanlış pozitif siRNA hedef dışı etkilerinin neden olduğu, söz konusu yollarının gerçek yeni düzenleyici kimlik dikkatli bir şekilde yapılan kontrol deneyleri bir dizi performans ile aşılabilir bu eksiklikleri, ağır basmaktadır.
Introduction
Ubikuitin ve ubikuitin benzeri moleküller (ubl'ler) ile proteinlerin modifikasyonu çeşitli biyolojik yollar ve stres yanıtlarını düzenleyen geniş bir biyokimyasal sistemini temsil eder. Hedef proteinlerine ubl'ler arasında kovalent bağlanması kararlılık, lokalizasyon, fonksiyon ya da alt tabaka 1 arasında interactome düzenleyen çeşitli çıktılarına sahip olabilir. UBL değişiklik yatan enzimatik adımlar İlk Ubiquitinle için kurulan ve şimdi SUMO, NEDD8, ISG15 ve FAT10 dahil olmak üzere çoğu ubl'ler ile değişiklik için bir paradigma olarak hizmet edilmiştir. Modifikasyonu oluştuğu için, UBL diglisin motifinin karboksilat grubu, ilk olarak bir E2 konjuge enzimin aktif yer sistein aktarılır yüksek enerjili bir tiol oluşturulması için bir E1 aktifleştirici enzim tarafından aktive edilir. E2 sonra (genellikle) bir dallı zincir (isopeptide) oluşturarak, bir hedef lizin tortusu bağlantı 2 üzerine ubl transferine vasıta olan bir alt-tabaka bağlı E3 ligaz ile etkileşime. Modifikasyon ardışık mermi doğrusal ubiquitin zincirleri oluşturmak için ubikuitin için yedi lisin herhangi biri aracılığıyla oluşabilir alt-tabaka, üstüne ya da N-terminal metionin ile isopeptide zincirleri oluşturmak için oluşabilir. Bu değişiklikler, önceden uzman proteazlar tarafından UBL kaldırılması için yeni etkileşim motifleri oluşturmak ve bozulması için proteinleri hedefleme gibi çeşitli amaçlar ile ayrık topolojilerini oluştururlar. Ubikitin durumunda iki E1 enzim, 30-40 E2 konjuge enzimler, en azından 600 E3 ligaz ve yaklaşık 100 deubiquitylating enzimler (seslendirmeler) vardır. Diğer yollar 10 kadar ubl'ler daha az geniş olsa da, genel olarak, belirli bir ubiquitome karmaşıklığı UBL modifikasyonu biyolojik sonucu olarak çok büyük bir çeşitlilik elde edilir. UBL biyoloji büyük ilerlemeler yapılmış iken Ancak, bu ubiquitome bileşenlerin çoğunluğunun hassas hücresel rolleri bilinmemektedir.
Kısa int kullanımıerfering ribonükleik asit (siRNA'lar), ayrı ayrı genlerin biyolojik rolü farklı bağlamlarda 3 incelenecek sağlayan nedeniyle özel olarak yok edilmesi için hücresel mRNA hedef siRNA'lar yeteneği ters genetik olarak güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Tüm genom ekranlar birçok hücresel süreçlerin yeni regülatörleri belirlemek ve doğrulamak için kullanılan olmuştur ve daha geniş bilimsel topluluk için erişilebilir kullanışlı bir veri zenginlik yaratmıştır. Tüm genom ekranlar son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır iken Ancak, hedeflenen ekranlar onlar daha ucuz olarak giderek daha popüler hale geliyor, daha hızlı, sadece araştırmacı en ilgi olduğu genomunun üyeleri üzerinde daha az veri yönetimi ve rapor içerir. Bu nedenle, daha iyi hücresel süreçleri UBL aile bileşenleri dahil hangi anlamak için, biz tüm bilinen ve ubiquitome bileşenleri tahmin hedefleyen bir insan siRNA kütüphane derledik. Bu ubl'ler, E1 aktifleştirici enzimler, E2 içeren konjugeenzimler, E3 ligaz, ubikuitin-bağlama alanı (UBD) ihtiva eden proteinler ve takar. Bu kütüphane, böylece bu yollar düzenleyen yeni UBL bileşenlerin ilgili teşhisine izin veren, farklı biyolojik sorunların raportör hücre hatlarının geniş bir karşı ekran kullanılabilir.
Aşağıdaki protokol titiz bir hedef siRNA hipoksi HIF1A bağımlı yanıtı yeni regülatörleri belirlemek için ubiquitome ekranını nasıl gerçekleştirileceği açıklanır. Normal oksijen basıncı altında, HIF1A bu Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligaz 4 tarafından tanınan karmaşık ve bozulma için hedef yol açar prolil hidroksilasyon tabidir. Hipoksi HIF1A stabilizasyonuna neden prolil hidroksilasyon inhibe eder ve bunun daha sonraki hipoksi karşılık elemanları (HRE'ler) bağlanma gen ekspresyonunu tahrik etmek için. Burada, stabil bir şekilde Hy üç tandem kopya kontrolü altında ateş böceği lusiferazı ifade eden U20S osteosarkoma hücreleri kullanılarak bir ekran tanımlamakpoxia yanıt elementi (HRE-U20S hücreleri) 5. Raportör etkinliğinin güçlü bir-okuma elde edilebilir ve uygun bir pozitif ve negatif kontroller ile birlikte alınabilir, bu protokol, herhangi bir biyolojik bir yol için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli hücrelerinde genom siRNA ekranların kullanılması ayrı biyolojik yollar ait yeni regülatörleri belirlenmesinde çok değerli olduğu kanıtlanmıştır. Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin regülatörleri belirlemek için bir hedef ubiquitome siRNA ekranın kullanımını tarif etmişlerdir. Genellikle, daha ucuz, daha hızlı, daha kolay yönetmek için ve sadece araştırmacılar 7, 10, 11 ilgilendikleri yolu bileşenleri raporu olarak hedeflenen ekranlar giderek daha çekici h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) ve Hücre Sinyalizasyon için İskoç Enstitüsü (MRC Protein fosforilasyonu ve Ubiquitylation birimin parçası) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
