Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
يخدم الهيم كمجموعة التعويضية لمجموعة واسعة من البروتينات المعروفة باسم hemoproteins، مثل الهيموغلوبين، والميوجلوبين cytochromes. وتشارك في مختلف العمليات الجزيئية والخلوية مثل النسخ الجيني والترجمة وتمايز الخلايا وتكاثر الخلايا. مستويات الحيوي من الهيم تختلف باختلاف الأنسجة المختلفة وأنواع الخلايا وغيرت في الحالات المرضية مثل فقر الدم واعتلال الأعصاب والسرطان. هذه التقنية تستخدم [4- 14 C] حمض 5-أمينوليفولنيك ([14 C] 5-ALA)، واحدة من السلائف في وقت مبكر من مسار الهيم الحيوي لقياس مستويات التوليف الهيم في خلايا الثدييات. هذا الاختبار يشمل حضانة الخلايا مع [14 C] 5-ALA تليها استخراج الهيم وقياس النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم. هذا الإجراء دقيق وسريع. يقيس هذا الأسلوب المستويات النسبية للالهيم الحيوي بدلا من المحتوى الكلي الهيم. للتدليل على استخدام هذا ميتاليكIQUE مستويات الهيم الحيوي قيست في العديد من خطوط الخلايا الثديية.
الهيم، وهو مجمع الحديد الحديدية وبروتوبرفيرين IX هو جزيء المركزي لنقل واستخدام الأوكسجين في الكائنات الحية تقريبا كل 1-3. هيكل فريد من الهيم تمكنه من العمل باعتبارها الناقل من الغازات ثنائية الذرة والالكترونات، وكذلك لأداء مختلف الوظائف الأخرى 1-5. على سبيل المثال، الهيم بربط الأوكسجين في الهيموجلوبين والميوجلوبين لنقل وتخزين 6،7 الأوكسجين. كما أنها تعمل حاملة الإلكترون في cytochromes خلال التنفس وتعمل كجهة مانحة الإلكترون لتفاعلات الأكسدة والاختزال التي حفزتها الانزيمات السيتوكروم P450 8،9. واحدة من السمات الأكثر أهمية من الهيم غير ذلك، فإنه يمكن أن تلعب الأدوار التنظيمية في العمليات الخلوية والجزيئية مثل النسخ الجيني، تخليق البروتين والصغرى RNA نشوء حيوي 4. على سبيل المثال، فإنه يؤثر على نسخ من العديد من الجينات من خلال مراقبة نشاط من الثدييات النسخي كاظمة Bach1 وتفصيل النووي الثديياتeptor القس-erbα 10-15. الهيم ينظم تفعيل بروتين الهيم المنشط (هاب) (1) الذي يلعب دورا هاما في تفعيل الجينات المسؤولة عن التنفس والسيطرة على الضرر التأكسدي، ردا على الهيم أو الأكسجين 16. ينظم الهيم أيضا النسخ الجيني في الخلايا العصبية عن طريق عامل نمو الأعصاب (NGF) يشير 3،17-20. كما ينظم تخليق البروتين في الخلايا محمر الثدييات عن طريق تحوير نشاط التنظيم الهيم eIF2α كيناز (HRI) 21-24. وعلاوة على ذلك، يؤثر الهيم نشاط البروتينات الأساسية يشير مثل التيروزين كيناز JAK2 والهلال الأحمر السوداني، والتي تعتبر ضرورية لعمل الخلية سليم و4،20،25 نمو الخلايا. فقد وجد أن في هيلا خلايا الهيم تثبيط يسبب اعتقال دورة الخلية وتفعيل علامات الشيخوخة المرتبطة وموت الخلايا المبرمج 26. وترتبط كل من هيم نقص أو زيادة مستويات الهيم مع آثار صحية خطيرة في البشر 27. والجزيئي الزوارالثانية وقد أظهرت الدراسات الوبائية وجود علاقة إيجابية من السعرات الهيم عالية وزيادة خطر الأمراض، مثل مرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والشرايين والسرطانات عدة بما في ذلك سرطان الرئة وسرطان القولون والمستقيم وسرطان البنكرياس 27،28. باستخدام زوج متطابق من مختبر خلايا الرئة العادية وسرطان المؤلفين وجدت أن الخلايا السرطانية قد زادت من مستويات استهلاك الأوكسجين، والتوليف الهيم والبروتينات المشاركة في امتصاص الهيم والأكسجين استخدام 28. ومن المثير للاهتمام، وتثبيط تخليق الهيم انخفض استهلاك الأكسجين، والانتشار، وتشكيل الهجرة ومستعمرة من الخلايا السرطانية 28. وبالتالي، فإن التقلبات في مستويات الهيم الذاتية يلعب دورا هاما في تنظيم العمليات الجزيئية والخلوية 3،4،28،29.
في الثدييات، والتخليق الحيوي للالهيم يحدث في ثماني خطوات، تشمل الإنزيمات الموجودة في الميتوكوندريا والعصارة الخلوية 4 (الشكل 1). الهيم biosynأطروحة تبدأ في المصفوفة الميتوكوندريا مع التكثيف من الجلايسين وsuccinyl، لجنة الزراعة لتكوين حمض 5-أمينوليفولنيك (5-ALA)، يحفزه ALA سينسيز (ALAS) 4،31. هذا هو معدل الحد خطوة في التخليق الحيوي الهيم في الخلايا nonerythroid. 5-ALA ومن ثم تصديرها إلى العصارة الخلوية التي تحدث فيها الخطوات الأربع المقبلة لتشكيل مولد الكوبروبرفيرين III (CPgenIII)، وهو ما يتم استيرادها إلى الميتوكوندريا، حيث يتم تحويلها إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX). وأخيرا، يتم تضمينها جزيء واحد من الحديد إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX) لإنتاج الهيم، وهو رد فعل يحفزه فيروكيلاتاز (FECH) 2،4.
مستوى الهيم الحيوي يعتمد بالدرجة الأولى على مستوى ALAS الانزيم الذي يسيطر بإحكام من قبل الحديد داخل الخلايا والهيم (4). الحيوي من الهيم يمكن أن تتأثر عيوب وراثية، وتوافر بعض المعادن والفيتامينات (على سبيل المثال، الريبوفلافين والزنك)، والتعرض للسموم (مثل الألومنيوم والرصاص)، نقص الأكسجين، والحمى، ومستويات بعض المنشطات (على سبيل المثال، الاستروجين) 32-35. يتم تبديل مستوى تخليق الهيم في مختلف الحالات المرضية. انخفضت الحيوي الهيم يمكن أن يسبب فقر الدم وكذلك الأمراض العصبية 3،36. بدلا من ذلك، زيادة الحيوي الهيم يلعب دورا هاما في تطور بعض أنواع السرطان 28،37. وقد تبين الهيم أن تكون حاسمة لنمو والتميز وبقاء الدهنية الثدييات، محمر والخلايا العصبية 4،38-41. على سبيل المثال، نقص الهيم يؤدي إلى تلف محوار في الماوس الأساسي العصبونات القشرية عن طريق تثبيط الغلوتامات NMDA (N -methyl-D اسبارتاتي) مستقبلات 17. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط تخليق الهيم يسبب موت الخلايا المبرمج في الإنسان الظهارية عنق الرحم سرطان خلايا هيلا 26،41. لذلك، وقياس مستويات الهيم الحيوي في خلايا مختلفة في ظل ظروف مختلفة المهم لدراسة المسببات وprogressiعلى العديد من الأمراض.
نحن هنا تصف طريقة سريعة وحساسة لقياس مستوى تخليق الهيم الخلايا باستخدام [4- 14 C] حمض 5-aminolevulic. هذا هو أسلوب بديل لأساليب أخرى باستخدام 55 أو الحديد 59 الحديد. نحن نفضل استخدام 14 C لإشعاعه ضعيف جدا. في المقابل، لا بد من حماية قوية للعمل مع نظائر الحديد. وعلاوة على ذلك، المقصود هذه الطريقة لقياس ومقارنة التوليف الهيم في خلايا مختلفة في موازاة ذلك بطريقة سريعة. من أجل قياس مستويات الهيم مطلقة، يمكن للمرء استخدام أسلوب المحددة سابقا التي تنطوي على استخدام HPLC 42،43.
الهيم يلعب دورا رئيسيا في توليد الطاقة الخلوية عن طريق التنفس 26. ومن المعروف غيرت الأيض الهيم أن تترافق مع أمراض مختلفة بما في ذلك السرطان 28،41. ومن المعروف تثبيط تخليق الهيم أن تسبب اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج في خلايا هيلا 26،41. وقد تبين ?…
The authors have nothing to disclose.
كانت خطوط الخلايا HCC4017 وHBEC30KT تفضلت التي تقدمها مختبر الدكتور جون مينا لل. وأيد هذا العمل من قبل أموال سيسيل H. وإيدا الأخضر للدكتور لى تشانغ.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |