JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Published: July 09, 2015
doi:
10.3791/51579
, ,
1Department of Molecular and Cell Biology, Center for Systems Biology,University of Texas at Dallas

Summary

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Abstract

Hæm tjener som den prostetiske gruppe for en bred vifte af proteiner kaldet hæmoproteiner såsom hæmoglobin, myoglobin og cytochromer. Det er involveret i forskellige molekylære og cellulære processer, såsom gen-transkription, translation, celledifferentiering og celleproliferation. Biosyntesen niveauer af hæm varierer på tværs af forskellige væv og celletyper og ændres i syge tilstande, såsom anæmi, neuropati og cancer. Denne teknik anvender [4- 14C] 5-aminolevulinsyre ([14C] 5-ALA), en af de tidlige forstadier i hæm-biosyntesevejen at måle indholdet af hæm syntese i pattedyrceller. Dette assay involverer inkubation af celler med [14C] 5-ALA efterfulgt af ekstraktion af hæm og måling af radioaktiviteten inkorporeret i hæm. Denne procedure er nøjagtig og hurtig. Denne metode måler de relative det samlede hæm indholdet niveauer af hæm biosyntesen stedet. For at demonstrere brugen af ​​denne technique niveauerne af hæm-biosyntese blev målt i flere mammale cellelinjer.

Introduction

Hæm, et kompleks af ferrojern og protoporphyrin IX er et centralt molekyle til transport og udnytte ilt i næsten alle levende organismer 1-3. Den unikke struktur af hæm gør det muligt at fungere som en bærer af diatomiske gasser og elektroner, samt til at udføre forskellige andre funktioner 1-5. For eksempel hæm binder sig til ilt i hæmoglobin og myoglobin til overførsel og opbevaring af ilt 6,7. Det virker også som en elektron luftfartsselskab i cytochromer under respiration og virker som en elektron donor for redoxreaktioner katalyseret af cytochrom P450 enzymer 8,9. En af de mest betydningsfulde træk ved hæm er, at det kan spille regulatoriske roller i cellulære og molekylære processer, såsom gentranskription, proteinsyntese og mikro-RNA biogenese 4. For eksempel den påvirker transkriptionen af ​​mange gener ved at styre aktiviteten af ​​pattedyr transskriptionsrepressor Bach1 og pattedyrs nukleare receptor Rev-erbα 10-15. Hæm regulerer aktiveringen af hæm aktivatorprotein (Hap) 1, som spiller en vigtig rolle i aktiveringen af gener involveret i respiration og styring oxidativ skade, som reaktion på hæm eller oxygen 16. Hæm også regulerer gentranskription i neuronale celler via nervevækstfaktor (NGF) signalering 3,17-20. Det regulerer også proteinsyntese i mammale erythroide celler ved at modulere aktiviteten af hæm-reguleret eIF2α kinase (HRI) 21-24. Desuden hæm påvirker aktiviteten af centrale signalering proteiner såsom tyrosinkinase Jak2 og Src, som er afgørende for korrekt celle funktion og cellevækst 4,20,25. Det konstateredes, at celler hæm inhibering i HeLa forårsager cellecyklusstandsning og aktivering af markører associeret med alderdom og apoptose 26. Både Heme mangel eller øget hæm er forbundet med alvorlige virkninger sundhed hos mennesker 27. Seneste molekylær ennd epidemiologiske undersøgelser har vist en positiv sammenhæng med høj hæm indtag og øget risiko for sygdomme, såsom type-2 diabetes, hjertesygdomme og flere kræftformer, herunder lungekræft, tarmkræft og bugspytkirtelkræft 27,28. Ved hjælp af en matchede par normale og cancer lungeceller forfatternes lab har fundet, at kræftceller har øget indhold af ilt forbrug, hæm syntese og proteiner involveret i hæm optagelse og ilt udnyttelse 28. Interessant inhibering af hæm syntese reduceret oxygenforbrug, proliferation, migration og kolonidannelse af kræftceller 28. Således udsving i niveauet af endogen hæm spiller en vigtig rolle i reguleringen af molekylære og cellulære processer 3,4,28,29.

I pattedyr biosyntesen af hæm forekommer i otte trin, der involverer enzymer placeret i mitokondrierne og cytosolen 4 (figur 1). Hæm Biosynafhandling begynder i matrixen af mitokondrier med kondensationen af glycin og succinyl-CoA til dannelse af 5-aminolevulinsyre (5-ALA), katalyseret af ALA synthase (desværre) 4,31. Dette er det hastighedsbegrænsende trin i hæm biosyntese i nonerythroid celler. 5-ALA derefter eksporteres ud til cytosolen, hvor de næste fire trin forekommer for at danne coproporphyrinogen III (CPgenIII), som derefter importeres tilbage til mitokondrierne, hvor det omdannes til protoporphyrin IX (PPIX). Endelig er et molekyle af jern inkorporeres i protoporphyrin IX (PPIX) til fremstilling af hæm, en reaktion katalyseret af ferrochelatase (FECH) 2,4.

Niveauet af hæm biosyntesen afhænger primært af niveauet af ALAS enzym, der er stramt styret af intracellulær jern og hæm 4. Biosyntesen af hæm kan påvirkes af genetiske defekter, tilgængelighed af visse mineraler og vitaminer (f.eks, riboflavin, zink), udsættelse for toksiner (fx aluminium, bly), Anoksi, feber og koncentrationer af visse steroider (f.eks østrogen) 32-35. Niveauet af hæm syntese ændres i forskellige sygdomstilstande. Nedsat hæm biosyntesen kan forårsage anæmi samt neurologiske sygdomme 3,36. Alternativt øget hæm biosyntesen spiller en vigtig rolle i udviklingen af visse kræftformer 28,37. Hæm har vist sig at være kritisk for vækst, differentiering og overlevelse af pattedyr adipose, erythroide og neuronale celler 4,38-41. For eksempel hæm mangel fører til neurit skader i primære muse corticale neuroner via hæmning af glutamat NMDA (N-methyl-D-aspartat) -receptoren 17. Derudover inhibering af hæm syntese forårsager programmeret celledød i den humane epitel cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Derfor er vigtig for at studere ætiologi og progressi måling af hæm biosyntese niveauer i forskellige celler under forskellige betingelserpå af mange sygdomme.

Her beskriver vi en hurtig og følsom metode til at måle niveauet af intracellulær hæm syntese ved anvendelse af [4- 14C] 5-aminolevulic syre. Dette er en alternativ metode til andre fremgangsmåder, der anvender 55 Fe eller 59 Fe. Vi foretrækker at bruge 14C fordi dens stråling er meget svag. I modsætning hertil er nødvendig for at arbejde med Fe isotoper stærk beskyttelse. Desuden er denne metode bestemt til at måle og sammenligne hæm syntese i forskellige celler i parallel på en hurtig måde. For at måle absolutte hæm niveauer, kan man anvende den tidligere fastsatte fremgangsmåde involverer anvendelsen af HPLC 42,43.

Protocol

ADVARSEL: Når du arbejder med radioaktivitet, træffe passende forholdsregler for at undgå forurening af forsøgslederen og omgivelserne. Bortskaf off alt affald efter lokale retningslinjer strålingssikkerhed. 1. Fremstilling af celler Seed celler i 3,5 cm plader, således at sammenflydning når op på 80% -90% på dagen for assayet. Bemærk, at podning konfluens for celler afhænger af den celletype og deres vækstrate. Ved behandling af cellerne med et reagens til et…

Representative Results

Denne metode blev anvendt til at sammenligne niveauerne af hæm syntese i normal (HBEC30KT) vs. cancer (HCC4017) lungeceller. Figur 2 viser en højere grad af hæm syntese i cancerceller (HCC4017) end normale lungeceller (HBEC30KT). Niveauet af hæm syntese blev også målt i normale celler og cancerceller i nærvær af mitokondrie afkobleren carbonyl cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP). Celler blev behandlet med 10 pM CCCP i 24 timer før målingen af ​​hæm syntese niveauer. Som forventet niveauer…

Discussion

Hæm spiller en central rolle i dannelsen af cellulære energi via respiration 26. Altered hæm stofskifte er kendt for at være forbundet med forskellige sygdomme herunder kræft 28,41. Inhibering af hæm syntese er kendt for at forårsage cellecyklusstop og apoptose i Hela-celler 26,41. Det er blevet vist, at høje hæm syntese niveau er forbundet med progressionen af lungecancerceller 28. Det ville derfor være af stor betydning at måle indholdet af hæm biosyntese i celle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De HCC4017 og HBEC30KT cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. John Minna laboratorium. Dette arbejde blev støttet af Cecil H. og Ida Grøn midler til Dr. Li Zhang.

Materials

Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store @  -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
 Specific reagent
Component Dispense
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) Acetone 25ml
Concentrated HCl 1.3ml
Water 5ml
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Tags

Heme SynthesisMammalian Cells[14C] 5-aminolevulinic AcidHeme BiosynthesisHemoproteinsCell DifferentiationCell ProliferationAnemiaNeuropathyCancer
check_url/kr/51579?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image