Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Heme dient als prosthetische groep voor een grote verscheidenheid aan eiwitten bekend als heemeiwitten, zoals hemoglobine, myoglobine en cytochromen. Het is betrokken bij verschillende moleculaire en cellulaire processen zoals gentranscriptie, translatie, celdifferentiatie en celproliferatie. De biosynthese van heem niveaus uiteenlopen weefsels en celtypes en wordt gewijzigd ziektetoestanden zoals bloedarmoede, neuropathie en kanker. Deze techniek maakt gebruik van [4- 14 C] 5-aminolevulinezuur ([14 C] 5-ALA), één van de vroege voorlopers in het heem biosyntheseweg het niveau van synthese van heem in zoogdiercellen te meten. Deze bepaling omvat incubatie van cellen met [14 C] 5-ALA, gevolgd door extractie van heem en meting van de radioactiviteit opgenomen in heem. Deze procedure is accuraat en snel. Deze werkwijze meet de relatieve niveaus van heem biosynthese plaats van het totale gehalte heem. Om het gebruik van deze techn tonenique de biosynthese van heem niveaus werden gemeten in verschillende zoogdiercellijnen.
Introduction
Heem, een complex van ferro-ijzer en protoporfyrine IX een bepaalde molecule voor transport en gebruik van zuurstof in vrijwel alle levende organismen 1-3. De unieke structuur van heem in staat stelt om te functioneren als drager van tweeatomige gassen en elektronen, alsook verschillende andere functies uitvoeren 1-5. Bijvoorbeeld bindt heem zuurstof van hemoglobine en myoglobine voor de overdracht en opslag van zuurstof 6,7. Het werkt ook als een elektron drager in de cytochromen uitgeademde fungeert als elektrondonor voor redox reacties gekatalyseerd door cytochroom P450-enzymen 8,9. Een van de belangrijkste kenmerken van heem is dat het regulerende rol kunnen spelen bij de cellulaire en moleculaire processen zoals gentranscriptie, eiwitsynthese en micro-RNA biogenese 4. Zo beïnvloedt de transcriptie van veel genen door regeling van de activiteit van zoogdier transcriptionele repressor Bach1 en het zoogdier nucleaire receptor Rev-erbα 10-15. Heme regelt de activering van haem activator-eiwit (Hap) 1 die een belangrijke rol bij de activatie van genen die betrokken zijn bij de ademhaling en controle oxidatieve beschadiging speelt, in reactie op heem of zuurstof 16. Heem regelt ook gentranscriptie in neuronale cellen via zenuwgroeifactor (NGF) signalering 3,17-20. Daarnaast regelt eiwitsynthese in zoogdiercellen erythroïde cellen door het moduleren van de activiteit van haem-gereguleerde kinase eIF2α (HRI) 21-24. Voorts heem beïnvloedt de activiteit van belangrijke signalering eiwitten zoals tyrosine kinase Jak2 en Src, die essentieel voor een goede celfunctie en celgroei 4,20,25 zijn. Gevonden werd dat bij HeLa-cellen heem remming veroorzaakt celcyclus en activering van markers geassocieerd met senescentie en apoptose 26. Beide Heem deficiëntie of verhoogde niveaus van heem in verband worden gebracht met ernstige gevolgen voor de gezondheid bij de mens 27. Recente moleculaire eennd epidemiologische studies een positieve associatie hoge heem inname en verhoogde kans op ziekten, zoals type-2 diabetes, coronaire hartziekten en verschillende kankers waaronder longkanker, colorectale kanker en pancreaskanker 27,28. Met behulp van een matched pair van lab normale en kanker longcellen auteurs hebben geconstateerd dat de kankercellen niveaus van zuurstofverbruik, heem synthese en eiwitten die betrokken zijn bij de opname van heem en zuurstofverbruik 28 zijn toegenomen. Interessant remming van synthese van heem verminderde zuurstofconsumptie, proliferatie, migratie en kolonievorming van kankercellen 28. Aldus, de fluctuatie in de niveaus van endogene heem speelt een belangrijke rol bij de regulatie van moleculaire en cellulaire processen 3,4,28,29.
In zoogdieren, de biosynthese van heem plaatsvindt in acht stappen, waarbij enzymen in de mitochondria en cytosol 4 (figuur 1). Heme Biosynthesis begint in de matrix van de mitochondriën met de condensatie van glycine en succinyl-CoA om 5-aminolevulinezuur (5-ALA) te vormen, gekatalyseerd door ALA-synthase (ALAS) 4,31. Dit is de snelheid stap in heem biosynthese in nonerythroid cellen te beperken. 5-ALA wordt vervolgens uitgevoerd naar het cytosol waar de volgende vier stappen uitgevoerd om coproporphyrinogen III (CPgenIII), die vervolgens naar de mitochondriën, waar het wordt omgezet in protoporfyrine IX (PPIX) wordt ingevoerd vormen. Tot slot wordt een molecuul ijzer opgenomen om de protoporfyrine IX (PPIX) naar heem, een reactie gekatalyseerd door ferrochelatase (Fech) 2,4 produceren.
Het niveau van heem biosynthese vooral afhankelijk van de mate van ALAS enzym die strak wordt gecontroleerd door intracellulair heem ijzer en 4. De biosynthese van heem kan worden beïnvloed door genetische afwijkingen, beschikbaarheid van bepaalde mineralen en vitaminen (bijvoorbeeld riboflavine, zink), blootstelling aan toxinen (bijvoorbeeld aluminium, lood), Anoxie, koorts en waarden van bepaalde steroïden (bijvoorbeeld oestrogeen) 32-35. Het niveau van synthese van heem wordt veranderd in diverse ziektetoestanden. Verminderde heem biosynthese kan bloedarmoede evenals neurologische aandoeningen 3,36 veroorzaken. Anderzijds verhoogde biosynthese van heem speelt een belangrijke rol bij de progressie van bepaalde kankers 28,37. Heem is getoond essentieel voor de groei, differentiatie en overleving van zoogdieren vet-, erythroïde en neuronale cellen 4,38-41 zijn. Bijvoorbeeld, heem-deficiëntie leidt tot neurieten schade primaire muis corticale neuronen via de remming van glutamaat NMDA (N-methyl-D-aspartaat) receptor 17. Bovendien remming van synthese van heem veroorzaakt geprogrammeerde celdood in humane epitheliale cervixcarcinoom HeLa-cellen 26,41. Derhalve meet het heem biosynthese niveaus in verschillende cellen onder verschillende condities is van belang voor het bestuderen etiologie en Progressieen van vele ziekten.
Hier beschrijven we een snelle en gevoelige methode om het niveau van intracellulair heem-synthese gemeten door [4- 14 C] 5-aminolevulic acid. Dit is een alternatieve methode om andere methoden waarbij 55 Fe of 59 Fe. We liever met behulp van 14 C, omdat de straling is zeer zwak. Daarentegen is een krachtige bescherming vereist voor het werken met Fe isotopen. Bovendien is deze werkwijze bedoeld voor het meten en vergelijken heemsynthese in verschillende cellen in parallel op een snelle wijze. Om absolute heme te meten, kan men de eerder vastgestelde werkwijze die het gebruik van HPLC 42,43 gebruiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heme speelt een belangrijke rol bij het genereren van cellulaire energie via ademhaling 26. Veranderde haem metabolisme is bekend dat zij samenhangen met verschillende ziekten waaronder kanker 28,41. Remming van de synthese van heem is bekend celcyclus en apoptose in HeLa cellen 26,41 veroorzaken. Er werd aangetoond dat hoge heemsynthese niveau wordt geassocieerd met de progressie van longkankercellen 28. Daarom zou het van groot belang zijn om de niveaus van heem biosyn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De HCC4017 en HBEC30KT cellijnen werden vriendelijk verschaft door Dr John Minna's lab. Dit werk werd ondersteund door de Cecil H. en Ida Green fondsen om Dr. Li Zhang.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
