מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Heme משמש כקבוצה התותבת למגוון רחב של חלבונים המכונים hemoproteins, כגון המוגלובין, מיוגלובין וcytochromes. הוא מעורב בתהליכים מולקולריים ותאיים שונים כגון שעתוק הגנים, תרגום, התמיינות תאים וחלוקה של תאים. רמות ביוסינתזה של heme להשתנות על פני רקמות שונות וסוגי תאים ומשתנות בתנאים חולים כגון אנמיה, נוירופתיה וסרטן. טכניקה זו משתמשת [4 14 C] חומצת 5-aminolevulinic ([14 C] 5-ALA), אחד מהמבשרים המוקדמים במסלול ביוסינתזה heme כדי למדוד את הרמות של סינתזת heme בתאי יונקים. assay זה כרוך דגירה של תאים עם [14 C] 5-עלא ואחרי חילוץ של heme ומדידה של הרדיואקטיביות שולבה heme. הליך זה הוא מדויק ומהיר. שיטה זו מודדת את הרמות היחסית של ביוסינתזה heme ולא מוחלט תוכן heme. כדי להדגים את השימוש בtechn זהique הרמות של ביוסינתזה heme נמדדו בכמה שורות תאי יונקים.
Introduction
Heme, קומפלקס של ברזל ברזלי ותשיעי protoporphyrin הוא מולקולה מרכזית להובלה וניצול חמצן באורגניזמים כמעט כל חיים 1-3. המבנה הייחודי של heme מאפשר לו לתפקד כנשא של גזים ואלקטרונים דו אטומיים, כמו גם לבצע פעולות שונות אחרות 1-5. לדוגמא, heme נקשר לחמצן בהמוגלובין ומיוגלובין להעברה והאחסון של 6,7 חמצן. זה עובד גם כמוביל אלקטרון בcytochromes במהלך נשימה ומשמש כתורם אלקטרונים לתגובות חמצון-חיזור מזורזות על ידי אנזימי ציטוכרום P450 8,9. אחת התכונות החשובות ביותר של heme הוא ש, הוא יכול לשחק תפקידי פיקוח בתהליכים תאיים ומולקולריים כגון שעתוק הגנים, סינתזת חלבון ומייקרו-רנ"א biogenesis 4. לדוגמא, זה משפיע על השעתוק של גנים רבים על ידי שליטה על הפעילות של מדכאי תעתיק יונקים Bach1 וrec הגרעיני היונקיםeptor Rev-erbα 10-15. Heme מסדיר את הפעלת חלבון activator heme (האפ) 1 אשר ממלא תפקיד חשוב בהפעלה של גני המעורבים בנשימה ושליטה נזק חמצוני, בתגובה לheme או חמצן 16. Heme גם מסדיר שעתוק הגנים בתאים עצביים באמצעות גורם גדילה עצבית (NGF) איתות 3,17-20. זה גם מסדיר את סינתזת חלבון בתאי יונקים erythroid על ידי ויסות הפעילות של קינאז מוסדר heme eIF2α (HRI) 21-24. יתר על כן, heme משפיע על פעילותם של חלבוני איתות מפתח כגון טירוזין קינאז Jak2 וSrc, שהם חיוניים לתפקוד תאים תקין ו4,20,25 צמיחת תאים. נמצא כי בהלה עיכוב heme תאים גורם לעצירת מחזור התא והפעלה של סמנים הקשורים להזדקנות ומות תאים מתוכן 26. שני חסר הרן או הרמות הגבוהות של heme המשויכות השפעות בריאותיות חמורות בבני אדם 27. מולקולרי האחרוןND מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשר חיובי של צריכת heme גבוהה וסיכון מוגבר למחלות, כגון סוכרת מסוג 2, מחלת לב כלילית וכמה סוגי סרטן, כולל סרטן הריאות, סרטן מעי גס וסרטן לבלב 27,28. בעזרת זוג תואם של המעבדה של המחברים תאי ריאה נורמלים והסרטן מצאו כי תאים סרטניים רמות גבוהות של צריכת חמצן, סינתזת heme וחלבונים המעורבים בספיגת heme וחמצן ניצול 28. מעניין לציין, עיכוב של סינתזת heme ירידה בצריכת חמצן, התפשטות, היווצרות הגירה ומושבה של תאים סרטניים 28. לפיכך, התנודות ברמות של heme אנדוגני ממלא תפקיד חשוב בויסות תהליכים מולקולריים ותאיים 3,4,28,29.
ביונקים, ביוסינתזה של heme מתרחשת בשמונה שלבים, הכולל אנזימים הממוקמים במיטוכונדריה וcytosol 4 (איור 1). biosyn hemeתזה מתחילה במטריצה של המיטוכונדריה עם העיבוי של גליצין וsuccinyl-CoA ליצירת חומצת 5-aminolevulinic (5-ALA), מזורז על ידי synthase ALA (אבוי) 4,31. זהו שיעור הגבלת צעד בביוסינתזה heme בתאי nonerythroid. 5-ALA לאחר מכן ייצא לcytosol בי ארבעה הצעדים הבאים להתרחש כדי ליצור coproporphyrinogen III (CPgenIII), אשר לאחר מכן מיובא חזרה למיטוכונדריה, שבו הוא הופך לIX protoporphyrin (PPIX). לבסוף, מולקולה אחת של ברזל משולב לIX protoporphyrin (PPIX) לייצר heme, תגובה מזורזת על ידי ferrochelatase (FECH) 2,4.
רמת ביוסינתזה heme תלויה בעיקר ברמה של אנזים אבוי שנתונה לפיקוח הדוקה על ידי ברזל וheme 4 תאיים. ביוסינתזה של heme יכולה להיות מושפעת מפגמים גנטיים, זמינות של מינרלים מסוימים וויטמינים (למשל, ריבופלאבין, אבץ), חשיפה לרעלים (למשל, אלומיניום, עופרת), אנוקסיה, חום, ורמות של סטרואידים מסוימים (לדוגמא, אסטרוגן) 32-35. רמת סינתזת heme משתנה בתנאים חולים שונים. ביוסינתזה heme ירד יכולה לגרום לאנמיה, כמו גם מחלות נוירולוגיות 3,36. לחלופין, ביוסינתזה heme המוגברת ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות של סרטן מסוים 28,37. Heme הוכח להיות קריטי לצמיחה, הבידול וההישרדות של שומן יונקים, erythroid ותאים עצביים 4,38-41. לדוגמא, מחסור heme מוביל לנזק neurite בנוירונים בקליפת המוח עכבר העיקרי באמצעות העיכוב של גלוטמט NMDA (N -methyl-D-aspartate) קולטן 17. בנוסף, עיכוב של סינתזת heme גורם למות תאים מתוכנת בקרצינומה של צוואר רחם אפיתל אדם תאי הלה 26,41. לכן, מדידת רמות ביוסינתזה heme בתאים שונים בתנאים שונים חשובה ללימוד אטיולוגיה וprogressiבמחלות רבות.
כאן אנו מתארים שיטה מהירה ורגישה למדידת הרמה של סינתזת heme תאית באמצעות חומצת 5-aminolevulic [4 14 C]. זוהי שיטה חלופית לשיטות אחרות באמצעות 55 או 59 Fe Fe. אנחנו מעדיפים להשתמש 14 C כי הקרינה שלה היא חלשה מאוד. לעומת זאת, הגנה חזקה נדרשת לעבודה עם איזוטופים פה. יתר על כן, בשיטה זו נועדה למדוד ולהשוות סינתזת heme בתאים שונים במקביל באופן מהיר. על מנת למדוד את רמות heme מוחלטות, ניתן להשתמש בשיטה שהוקמה בעבר בתחום השימוש בHPLC 42,43.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heme ממלא תפקיד מרכזי בדור של אנרגיה תאית באמצעות נשימה 26. חילוף החומרים heme שינה ידוע להיות קשורים למחלות שונות, כוללים סרטן 28,41. עיכוב של סינתזת heme ידוע כגורם לעצירת מחזור התא ואפופטוזיס בתאי הלה 26,41. הוכח שרמת סינתזה הגבוהה heme קשור ההתקדמות של תאי סרט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
שורות תאי HCC4017 וHBEC30KT נמסרו באדיבות על ידי המעבדה של ד"ר ג'ון מינה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות ססיל ה 'ואידה הירוקה לד"ר לי ג'אנג.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
