Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Heme tjänar som prostetisk grupp för ett stort antal olika proteiner som kallas hemoproteiner, såsom hemoglobin, myoglobin och cytokrom. Den är involverad i olika molekylära och cellulära processer såsom gen transkription, translation, celldifferentiering och cellproliferation. Biosyntesen nivåer hem varierar mellan olika vävnader och celltyper och förändras i sjukdomstillstånd såsom anemi, neuropati och cancer. Denna teknik använder [4- 14 C] 5-aminolevulinsyra ([14 C] 5-ALA), en av de tidiga prekursorer i heme biosyntesvägen för att mäta nivåerna av hemsyntesen i däggdjursceller. Denna analys innefattar inkubering av celler med [14 C] 5-ALA, följt av extraktion av hem och mätning av radioaktiviteten inkorporeras i heme. Detta förfarande är korrekt och snabb. Denna metod mäter de relativa nivåerna av hembiosyntes snarare än den totala hem innehållet. För att demonstrera användningen av denna TechnIQUE nivåerna av hembiosyntes mättes i flera däggdjurscellinjer.
Heme, är ett komplex av ferrojärn och protoporfyrin IX en central molekyl för att transportera och utnyttja syre i så gott som alla levande organismer 1-3. Den unika strukturen av hem gör att den kan fungera som en bärare av diatomic gaser och elektroner, liksom att utföra olika andra funktioner 1-5. Till exempel, binder hem till syre i hemoglobin och myoglobin för överföring och lagring av syre 6,7. Den fungerar också som en elektronbärare i cytokrom under andning och fungerar som en elektrondonator för redoxreaktioner katalyserade av cytokrom P450-enzymer 8,9. En av de viktigaste funktionerna i hem är att det kan spela regulatoriska roller i cellulära och molekylära processer såsom gentranskription, proteinsyntes och mikro RNA biogenes 4. Till exempel, det påverkar transkriptionen av många gener genom att styra aktiviteten hos däggdjurs transkriptionsrepressor Bach1 och däggdjurs nukleära receptor Rev-erbα 10-15. Heme reglerar aktiveringen av heme aktivatorprotein (Hap) en som spelar en viktig roll i aktiveringen av gener involverade i andning och styrning av oxidativ skada, som svar på heme eller syre 16. Heme reglerar också gentranskription i nervceller via nervtillväxtfaktor (NGF) signalering 3,17-20. Det reglerar också proteinsyntes i däggdjurs erytroidceller genom att modulera aktiviteten hos heme-reglerade eIF2α kinas (HRI) 21-24. Dessutom påverkar hem aktiviteten av viktiga signalproteiner såsom tyrosinkinas JAK2 och Src, som är nödvändiga för korrekt cell fungerar och celltillväxt 4,20,25. Det visade sig att i HeLa-celler heme hämning orsakar cellcykelstopp och aktivering av markörer associerade med senescens och apoptos 26. Både Heme brist eller ökade nivåer av hem är förknippade med allvarliga hälsoeffekter hos människor 27. Senaste molekyl ennd epidemiologiska studier har visat ett positivt samband med hög hem intag och ökad risk för sjukdomar, såsom typ-2-diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och flera cancerformer, inklusive lungcancer, tjock- och ändtarmscancer och pankreascancer 27,28. Med hjälp av ett matchat par av normala och cancerlungceller författarnas laboratorium har funnit att cancerceller har ökade nivåer av syreförbrukning, hemsyntesen och proteiner involverade i hem upptag och syre utnyttjande 28. Intressant, minskade hämningar av hemsyntesen syreförbrukning, spridning, migration och kolonibildning av cancerceller 28. Således variationer i nivåerna av endogen hem spelar en viktig roll i regleringen av molekylära och cellulära processer 3,4,28,29.
I däggdjur sker biosyntesen av heme i åtta steg, som involverar enzymer lokaliserade i mitokondrierna och cytosolen 4 (fig 1). Heme Biosynavhandlingen börjar i matrisen av mitokondrier med kondensering av glycin och succinyl-CoA för att bilda 5-aminolevulinsyra (5-ALA), katalyserad av ALA-syntas (ALAS) 4,31. Detta är det hastighetsbegränsande steget i hembiosyntes i nonerythroid celler. 5-ALA sedan exporteras ut till cytosolen där de nästa fyra steg inträffa för att bilda coproporphyrinogen III (CPgenIII), som sedan importeras tillbaka till mitokondrierna, där den omvandlas till protoporfyrin IX (PPIX). Slutligen är en molekyl av järn införlivas till protoporfyrin IX (PPIX) för framställning av heme, en reaktion som katalyseras av ferrokelatas (FECH) 2,4.
Nivån på hembiosyntes beror främst på graden av ALAS enzym som tätt styres av intracellulärt järn och heme 4. Biosyntesen av hem kan påverkas av genetiska defekter, tillgänglighet av vissa mineraler och vitaminer (t.ex., riboflavin, zink), exponering för toxiner (t.ex. aluminium, bly), Anoxi, feber, och nivåerna av vissa steroider (t.ex. östrogen) 32-35. Nivån på hemsyntesen förändras hos olika sjukdomstillstånd. Minskad biosyntesen hem kan orsaka blodbrist samt neurologiska sjukdomar 3,36. Alternativt spelar ökad biosyntes hem en viktig roll i utvecklingen av vissa cancerformer 28,37. Heme har visat sig vara avgörande för tillväxten, differentieringen och överlevnaden av däggdjur fettvävnad, erytroida och nervceller 4,38-41. Exempelvis leder heme-brist till neurite skada i primära mus kortikala neuroner via inhibition av glutamat NMDA (N-metyl-D-aspartat) -receptor 17. Dessutom, hämning av hemsyntesen orsakar programmerad celldöd i människans epitel cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Därför är det viktigt för att studera etiologi och progressi mäta hembiosyntes nivåer i olika celler under olika betingelserpå många sjukdomar.
Här beskriver vi en snabb och känslig metod för att mäta nivån av intracellulär hemsyntesen genom användning av [4- 14 C] 5-aminolevulic syra. Detta är en alternativ metod för att andra metoder som använder 55 Fe eller 59 Fe. Vi föredrar att använda 14 C, eftersom dess strålning är mycket svag. Däremot krävs ett starkt skydd för att arbeta med Fe isotoper. Dessutom är denna metod till syfte att mäta och jämföra hemsyntesen i olika celler parallellt på ett snabbt sätt. För att mäta absoluta heme nivåer, kan man använda den tidigare etablerad metod som omfattar användning av HPLC 42,43.
Heme spelar en nyckelroll i uppkomsten av cell energi via andning 26. Förändrad hem ämnesomsättning är känd för att vara förknippade med olika sjukdomar, bland annat cancer 28,41. Inhibering av hemsyntesen är känt för att orsaka cellcykelstopp och apoptos i Hela-celler 26,41. Det har visats att hög hemsyntesen nivå är förknippad med utvecklingen av lungcancerceller 28. Därför skulle det vara av stor betydelse för att mäta nivåerna av hembiosyntes i celler u…
The authors have nothing to disclose.
De HCC4017 och HBEC30KT cellinjer tillhandahölls vänligen av Dr John Minna labb. Detta arbete stöddes av Cecil H. och Ida Gröna medel till Li Zhang.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |