Elastin तरह polypeptides पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्धि से दवा वितरण को लेकर आवेदन के साथ प्रोत्साहन उत्तरदायी biopolymers हैं. इस प्रोटोकॉल क्रोमैटोग्राफी करने के लिए एक सरल विकल्प के रूप में उनकी कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान चरण संक्रमण व्यवहार का उपयोग कोलाई से इलास्टिन तरह polypeptides और उनके पेप्टाइड या प्रोटीन fusions की शुद्धि और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है.
Elastin तरह polypeptides एक विशेषता संक्रमण तापमान नीचे के रूप में घुलनशील युनिमर्स मौजूदा और उनके संक्रमण तापमान ऊपर माइक्रोन पैमाने coacervates में कुल एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान चरण संक्रमण व्यवहार है कि प्रदर्शन के दोहराव biopolymers हैं. आनुवंशिक स्तर पर इलास्टिन तरह polypeptides के डिजाइन उनकी थर्मल गुण पैदा करती है जो उनके अनुक्रम और लंबाई, सटीक नियंत्रण के लिए परमिट. Elastin तरह polypeptides biosensing, ऊतक इंजीनियरिंग, और ELP के संक्रमण के तापमान और biopolymer वास्तुकला ब्याज की विशेष आवेदन के लिए देखते जा सकता है, जहां दवा वितरण, सहित आवेदन की एक किस्म में उपयोग किया जाता है. इसके अलावा, इलास्टिन तरह polypeptides के कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान चरण संक्रमण व्यवहार उनके थर्मल प्रतिक्रिया द्वारा उनकी शुद्धि की अनुमति देता है उनके चयनात्मक अंबर और resolubilization की अनुमति देता है कि इस तरह दोनों घुलनशील और अघुलनशील संदूषक को हटानेएस कोलाई में अभिव्यक्ति निम्नलिखित. यह दृष्टिकोण इलास्टिन तरह polypeptides अकेले या आनुवंशिक रूप इलास्टिन तरह पॉलीपेप्टाइड टैग के साथ जोड़ दिया पुनः संयोजक पेप्टाइड या प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी बिना शुद्ध किया जा सकता है, जहां पेप्टाइड या प्रोटीन fusions के लिए एक शुद्धि उपकरण के रूप में की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल इलास्टिन तरह polypeptides और उनके पेप्टाइड या प्रोटीन fusions की शुद्धि का वर्णन करता है और शुद्ध इलास्टिन तरह पॉलीपेप्टाइड उत्पादों की थर्मल व्यवहार का आकलन करने के लिए बुनियादी लक्षण वर्णन तकनीक पर चर्चा.
Elastin तरह polypeptides (ELPs) एक्स, अतिथि छाछ, प्रोलाइन को छोड़कर किसी भी एमिनो एसिड है जहां दोहराई pentapeptide VPGXG से बना biopolymers हैं. ELPs प्रदर्शनी कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) चरण संक्रमण व्यवहार, एक सजातीय ELP समाधान सामान्यतः ELP साहित्य 1 में उलटा संक्रमण तापमान (टी टी) कहा जाता है जो अपने LCST, हीटिंग पर दो चरणों में अलग होगा कि इस तरह के. दो चरणों में एक बहुत ही पतला ELP छोटा गोला चरण और एक ELP अमीर तलछट चरण से बना रहे हैं. ELP अमीर तलछट बाद में संगठित होना कि माइक्रोन आकार के कणों में ELP श्रृंखला के एकत्रीकरण पर एक छोटी timescale पर बनाई है. यह व्यवहार कुछ डिग्री सेल्सियस की एक सीमा से अधिक होता है और एक सजातीय समाधान टी टी नीचे के तापमान को लौटने पर बरामद किया है, जैसा कि आम तौर पर पलटवाँ है.
ELPs आमतौर पर fro Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) में संश्लेषित कर रहे हैंएक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में ligated है कि एक कृत्रिम जीन एम. यह प्लाज्मिड तो एक ई. में तब्दील हो जाता है प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम है कि कोली सेल लाइन. हम विशेष रूप से ई. में ELPs की एक विशाल विविधता की अभिव्यक्ति के लिए T7-लाख पीईटी वेक्टर प्रणाली का इस्तेमाल किया है कोलाई, खमीर 2-4, कवक 5, और पौधों 6-8 में अन्य अभिव्यक्ति सिस्टम भी अन्य जांचकर्ताओं द्वारा उपयोग किया गया है. दृष्टिकोण की संख्या आनुवंशिक रूप से पुनरावर्ती दिशात्मक बंधाव (RDL) 9, प्लाज्मिड पुनर्निर्माण (पूर्व RDL) 10 से पुनरावर्ती दिशात्मक बंधाव सहित दोहराए ELP जीन का निर्माण करने के लिए मौजूद हैं, और विस्तार रोलिंग चक्र प्रवर्धन (OERCA) 11 ओवरलैप. आनुवंशिक स्तर पर ELPs इंजीनियर की क्षमता आगे कार्यात्मक के साथ संलग्न किया जा सकता है जो आर्किटेक्चर की एक किस्म (जैसे, monoblocks, diblocks, Triblocks, आदि) के साथ ELPs बनाने के लिए पुनः संयोजक डीएनए तकनीक का उपयोग करने का अवसर देता हैपेप्टाइड्स और प्रोटीन. आनुवंशिक स्तर पर नियंत्रण भी प्रत्येक ELP पूरी monodisperse biopolymer उत्पाद उपलब्ध कराने, सटीक लंबाई और इसकी आनुवंशिक प्लाज्मिड टेम्पलेट से तय रचना के साथ व्यक्त किया है कि यह सुनिश्चित करता है.
प्रत्येक ELP के तापीय गुणों ऐसी अपनी आणविक वजन (मेगावाट) और अनुक्रम, साथ ही इसके समाधान में एकाग्रता और लवण जैसे अन्य cosolutes, की उपस्थिति सहित बाह्य कारकों के रूप में biopolymer को आंतरिक मापदंडों पर निर्भर करते हैं. ELP 12 और उसके अतिथि अवशेषों रचना की लंबाई 1, 13, 14 हाइड्रोफोबिक अतिथि अवशेषों और अब श्रृंखला लंबाई कम टी टी एस में परिणाम जहां टी टी, नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ELP डिजाइन में दो orthogonal मापदंडों, जबकि हाइड्रोफिलिक हैं अतिथि अवशेषों और छोटे श्रृंखला लंबाई उच्चतर टी टी एस में परिणाम. ELP एकाग्रता inversely टी टी, जीआर की जहां समाधान से संबंधित हैभक्षक ELP एकाग्रता कम टी टी एस 12 है. नमक के प्रकार और एकाग्रता भी लवण का असर Hofmeister श्रृंखला 15 इस प्रकार है जहां ELP टी टी, प्रभावित करते हैं. Kosmotropic anions (CL – और Hofmeister श्रृंखला पर उच्च) ELP टी टी कम और बढ़ती नमक एकाग्रता इस प्रभाव को बढ़ाता है. इन आंतरिक और बाह्य मापदंडों एक ELP की एक विशेष आवेदन के लिए आवश्यक है कि एक लक्ष्य तापमान सीमा के भीतर थर्मल व्यवहार प्राप्त करने के लिए देखते जा सकता है.
ELPs की उत्तेजना जिम्मेदार व्यवहार biosensing 16, 17, ऊतक इंजीनियरिंग 18, और दवा वितरण 19, 20 सहित आवेदन की एक विविध रेंज के लिए उपयोगी है. ELPs आनुवंशिक स्तर पर पेप्टाइड्स या प्रोटीन के लिए जुड़े हुए हैं ही, जब ELP पुनः संयोजक पीईपी की शुद्धि के लिए एक सस्ती बैच विधि प्रदान करने के लिए एक सरल शुद्धि टैग के रूप में सेवा कर सकते हैंकोई क्रोमैटोग्राफी 21 की आवश्यकता है कि ज्वार या प्रोटीन. शुद्धिकरण की प्रक्रिया के संशोधन ELP के लिए जुड़े हुए पेप्टाइड या प्रोटीन की गतिविधि को बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करता है. पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions ELP टैग 22, 23 या वैकल्पिक रूप से, मुफ्त पेप्टाइड या प्रोटीन की आवश्यकता होती है, जब एक प्रोटीज मान्यता साइट पेप्टाइड या प्रोटीन और ELP के बीच डाला जा सकता है उपयोगी है जिसमें अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध किया जा सकता है. ELP टैग को हटाने की प्रक्रिया मुक्त प्रोटीज या बाद के लक्ष्य पेप्टाइड या से ELP टैग और प्रोटीज ELP फ्यूजन अलग नहीं कर सकता ELP शुद्धि के अंतिम दौर के रूप में प्रसंस्करण के अतिरिक्त आसानी प्रदान करता है, जहां एक प्रोटीज ELP संलयन, साथ पाचन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है एक भी कदम 24, 25 में प्रोटीन. निम्नलिखित प्रोटोकॉल उनके तापीय गुणों के माध्यम से ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions के लिए शोधन प्रक्रिया का वर्णन और निस्र्पक के लिए बुनियादी तकनीकों की चर्चाELP उत्पादों की थर्मल प्रतिक्रिया.
ELPs उनके प्रोत्साहन संवेदनशील चरण व्यवहार के शोषण से शुद्धि का एक सस्ता और क्रोमैटोग्राफी मुक्त साधन प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण ई. में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ELPs की अभिव्यक्ति के बाद दोनों घुलनशील और अघुलनशील contaminants को खत्म करने ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions की LCST व्यवहार का लाभ लेता है कोलाई. शुद्धि का यह आसानी आवेदनों की एक किस्म के लिए ELPs निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या ELP बाद शुद्धि प्रसंस्करण के साथ हटाया जा सकता है कि एक शुद्धि टैग के रूप में कार्य कर सकते हैं जिसमें पुनः संयोजक पेप्टाइड या प्रोटीन की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.
ELP शुद्धि ई. lyse करने के लिए प्रारंभिक चरण शामिल कोली और आईटीसी द्वारा अवशिष्ट घुलनशील और अघुलनशील प्रदूषणों से हटाने (चित्रा 2) के बाद कच्चे तेल की संस्कृति lysate (चित्रा 1), से जीनोमिक और अघुलनशील सेल मलबे को हटा दें. केन्द्रापसारण addi द्वारा ELP संक्रमण ट्रिगर के बादगर्मी या नमक की tion के एक कदम के लिए एक हॉट स्पिन करार में, सतह पर तैरनेवाला में घुलनशील contaminants से ELP अलग करती है. ELP resolubilizing के बाद, समाधान, अघुलनशील संदूषक गोली को निकालने के लिए टी टी नीचे के तापमान पर फिर centrifuged है एक कदम में एक ठंड स्पिन करार दिया. गर्म और ठंडे spins बारी उपज के लिए एक छोटी सी कीमत पर, प्रत्येक चक्र के साथ ELP समाधान की शुद्धता में सुधार. शोधन पैदावार ELP टी टी, लंबाई, और इनकार पेप्टाइड या प्रोटीन पर निर्भर है. आमतौर पर, इस प्रोटोकॉल ई. प्रति लीटर शुद्ध किया ELP की 100 मिलीग्राम की पैदावार कोली संस्कृति, हालांकि पैदावार 500 मिलीग्राम / एल तक पहुंच सकता है ELP उत्पाद की अंतिम पवित्रता एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 3) द्वारा की पुष्टि की है. शुद्ध ELP मेगावाट ELP जीन द्वारा इनकोडिंग सैद्धांतिक मेगावाट के साथ मिलकर मैच चाहिए. हालांकि, कुछ ELPs उनकी उम्मीद मेगावाट 9, 27 से ऊपर के लिए 20% अधिक एक स्पष्ट मेगावाट साथ एसडीएस पृष्ठ में चले जाते हैं. ELP के और अधिक सटीक विश्लेषणमेगावाट भी इस तरह के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के रूप में ओर्थोगोनल विश्लेषणात्मक तकनीकों के साथ ELP उत्पाद की शुद्धता पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं जो MALDI-TOF-एमएस, के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
शुद्धि के बाद, ELP टी टी तापमान क्रमादेशित turbidimetry से मापा जाता है. तापमान में वृद्धि हुई है, जबकि इस तकनीक को एक ELP समाधान के आयुध डिपो का निरीक्षण करता है. यह ELP का इरादा आवेदन के लिए प्रासंगिक एक एकाग्रता श्रृंखला चिह्नित करने के लिए सलाह दी जाती है ताकि टी टी एकाग्रता निर्भर है. ELP मैलापन प्रोफाइल UNIMER को माइक्रोन पैमाने समुच्चय से ELP संक्रमण से मेल खाती है कि एक भी तेजी से वृद्धि (चित्रा -4 ए) प्रदर्श homopolymers लिए. टी टी ठीक तापमान के संबंध में आयुध डिपो के पहले व्युत्पन्न के रूप में अधिकतम निर्धारित मैलापन प्रोफाइल में मोड़ बिंदु को इसी तापमान के रूप में परिभाषित किया गया है. के उलटनेELP चरण संक्रमण तापमान टी टी (चित्रा 4 बी) से नीचे उतारा है के रूप में आधारभूत आयुध डिपो में कमी से इसकी पुष्टि की है. तापमान रैंप वृद्धि और कमी के साथ मैलापन प्रोफाइल की वजह से ELP coacervates और ELP resolubilization के चर हिस्टैरिसीस के निपटाने के लिए परिमाण और कैनेटीक्स में अलग होगा. पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions इसी ELP के लिए जुड़े हुए पेप्टाइड या प्रोटीन टी टी को प्रभावित करता है, जहां इस तरह से, में LCST व्यवहार दिखा रहे हैं. प्रोटीन के लिए ELP संक्रमण प्रोटीन के पिघलने तापमान नीचे प्रतिवर्ती है fusions. तापमान क्रमादेशित turbidimetry ऐसे अंतर स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) के रूप में ELP उत्पादों, वैकल्पिक तकनीकों के प्रारंभिक थर्मल लक्षण वर्णन के लिए एक शानदार तरीका है, वहीं यह भी ELP टी टी मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
भी तापमान कार्यक्रम के द्वारा होती जा सकता है कि और अधिक जटिल आर्किटेक्चर प्रदर्शनी अधिक जटिल थर्मल व्यवहार के साथ ELPsMMed turbidimetry. ELP diblock सहपॉलिमरों, उदाहरण के लिए, उनके महत्वपूर्ण micellization तापमान पर गोलाकार मिसेल्स में अपने तापमान ट्रिगर विधानसभा स्वयं को इसी विशेषता मैलापन प्रोफाइल दिखा रहे हैं. ऐसे ELP diblock सहपॉलिमरों के लिए ओवर ड्राफ्ट आम तौर पर पहले एक उच्च तापमान पर आयुध डिपो में तेजी से वृद्धि (अप करने के लिए 2.0 इकाइयों आधारभूत ऊपर) माइक्रोन पैमाने के गठन को इंगित करता है, जिसके बाद मिसेल्स को युनिमर्स से संक्रमण का संकेत आधारभूत ऊपर 0.1-0.5 इकाइयों बढ़ जाती है समुच्चय (चित्रा 5A). तापमान ट्रिगर आत्म इकट्ठे ELP संरचनाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी DLS, समाधान में ELP विधानसभाओं के आर एच उपाय है कि एक तकनीक के साथ प्राप्त की है. आर एच में परिवर्तन turbidimetry (चित्रा 5 ब) के साथ मापा आयुध डिपो में परिवर्तन के साथ मिलकर सहमत हैं. Nanoparticle विधानसभाओं एक आर एच प्रदर्शन एक आर एच ~ 20-100 एनएम और समुच्चय का प्रदर्शन करते हुए ELP युनिमर्स आम तौर पर एक आर एच <10 एनएम का प्रदर्शन </suबी >> 500 एनएम. इस तरह के एकत्रीकरण संख्या और आकृति विज्ञान के रूप में स्वयं को इकट्ठा ELP नैनोकणों के बारे में अतिरिक्त जानकारी, स्थिर प्रकाश बिखरने या क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 17, 23, 29 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
कारण ELP तापीय गुणों की tunability के लिए, टी टी एस की एक सीमा के विभिन्न ELP डिजाइन द्वारा प्राप्त की है. यह निहित टी टी बेहद कम या उच्च टी टी एस इस मानक प्रोटोकॉल के लिए सबसे संशोधन की आवश्यकता होगी, जहां प्रत्येक ELP, के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल का अनुकूलन को प्रभावित करती है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है. अत्यंत उच्च संक्रमण तापमान के साथ ELPs इस दृष्टिकोण के साथ शुद्धि के लिए अनुपयुक्त हो सकती है. उपन्यास ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions के डिजाइन ELP के थर्मल प्रतिक्रिया समझौता हो सकता है, एक साधारण हिस्टडीन टैग immobilized धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा वैकल्पिक शुद्धि के लिए शामिल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त,अतिथि अवशेषों का आरोप लगाया है अगर ELP अनुक्रम की विशेषताओं इस प्रोटोकॉल के संशोधन की आवश्यकता हो सकती है. बफर पीएच के हेरफेर contaminants 17 के साथ बातचीत electrostatic को खत्म करने के प्रयास में ELP के समग्र प्रभारी बदलने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पेप्टाइड्स और उचित उपाय शुद्धिकरण की प्रक्रिया में जुड़े हुए आधा भाग की गतिविधि उपद्रव नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है जब प्रोटीन के साथ ELP fusions की विशेष परिस्थितियों के लिए उपयुक्त है. ऐसे संशोधनों पर प्रोटोकॉल भर नोट्स टी टी, प्रभारी, या संलयन चिंताओं के संबंध में इन चुनौतियों उपस्थित हो सकता है कि ELPs की शुद्धि निर्देशित करने के लिए काम करते हैं.
उनके LCST व्यवहार के माध्यम से ELPs की शुद्धि ई. में व्यक्त ELPs का बहुमत और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions शुद्ध करने के लिए एक सरल और क्रोमैटोग्राफी मुक्त दृष्टिकोण प्रस्तुत कोलाई. यहाँ संक्षेप प्रोटोकॉल शुद्धि ओ परमिटF सबसे जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए आम है कि उपकरण का उपयोग कर एक ही दिन में ELPs. ELPs और उनके fusions की शुद्धि में आसानी, हम आशा है, पदार्थ विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी, और चिकित्सा के क्षेत्र में नए अनुप्रयोगों के लिए ELP डिजाइन की एक बढ़ती विविधता को प्रोत्साहित करेंगे.
The authors have nothing to disclose.
यह काम NSF के अनुसंधान त्रिभुज MRSEC (DMR-1121107) द्वारा समर्थित किया गया.
pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels. |
Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |