والرنا الميكروي (ميرنا) لمحات من الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (آي بي إس) الخلايا، والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من الإنسان يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) خلايا (IPS-RPE)، وRPE الجنين، وتمت مقارنة.
الهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات لمقارنة الرنا الميكروي (ميرنا) لمحات من الإنسان يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) الخلايا، والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من خلايا الجذع الإنسان (IPS-RPE)، وRPE الجنين. وتشمل البروتوكولات جمع الحمض النووي الريبي لتحليلها من قبل ميكروأري، وتحليل البيانات ميكروأري لتحديد miRNAs التي أعرب تفاضلي بين ثلاثة أنواع الخلايا. يتم شرح طرق لثقافة خلايا الجذع وRPE الجنين. كما يتم وصف بروتوكول يستخدم لتمايز RPE من الجذع الإنسان. وقد تم اختيار تقنية استخراج الحمض النووي الريبي وصفنا للسماح الانتعاش القصوى من الحمض النووي الريبي الصغيرة جدا للاستخدام في ميكروأري ميرنا. أخيرا، وأوضح مسار الخلوية وتحليل شبكة من البيانات ميكروأري. وهذه التقنيات تسهيل المقارنة بين ملامح ميرنا من ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا.
الخلايا الجذعية لديها القدرة على تكرار بلا حدود والقدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية. وقد أثارت تطوير تقنيات لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة الإثارة كبيرة في الأوساط البحثية وبين الأطباء، وظهور شخصية تجديد الأنسجة تلوح في الأفق 1. الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الخلايا يحمل نفس الميزات من إمكانات غير محدودة وتعدد القدرات تنسخي كما الجذعية الجنينية (ES) الخلايا في حين التحايل على المعضلات الأخلاقية المرتبطة المجالس الاقتصادية والاجتماعية. بالإضافة إلى ذلك، سوف الخلايا الجذعية المشتقة من المريض لا تحفز الاستجابة المناعية، مما يزيد كثيرا من احتمال التطبيقات العلاجية الناجحة 2-3. في ظل ظروف ثقافة محددة، وقد ثبت أن خلايا الجذع على التمايز إلى عدة أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر، بما في ذلك العضلية، الخلايا العصبية، خلايا بيتا في البنكرياس، الكبد، وظهارة الصباغية الشبكية (RPE) 4-12.
وRPE هو عبارة عن طبقة من الخلايا الظهارية المتخصصة المصطبغة تقع في الجزء الخلفي من شبكية العين التي تنفذ العديد من الوظائف التي تعتبر أساسية للصحة البصرية وظيفة مثل امتصاص الضوء الشارد، البلعمة من شرائح مبصرة الخارجي، وتجهيز الرتينوئيدات لإنتاج من حامل اللون البصرية. خلل في RPE بسبب الضرر أو مرض يؤثر تأثيرا عميقا الصحية مبصرة وظيفة البصرية كما يتضح من الأمراض المسببة للعمى التي هي نتيجة لالكامنة علم الأمراض RPE مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، ومرض ستارغاردت، والتهاب الشبكية الصباغي (RP) 13. لم تتحقق علاجات فعالة حقا أن يمكن استعادة الرؤية، واستبدال RPE المريضة مع RPE صحية قد يكون الخيار الأفضل لمنع فقدان البصر 14-15. RPE المستمدة من الجذع (IPS-RPE) هو مصدر ممكن من الخلايا لتحل محل RPE التالفة. IPS-RPE عن characterisالبروتينات RPE التشنج الانتقال بعيد المدى المحددة، CRALBP، PEDF، وRPE65؛ يعرض الكلاسيكية المصطبغة للغاية التشكل RPE سداسية؛ ويؤدي وظائف RPE مثل البلعمة، وتجهيز ريتينويد، وإفراز 11 – 5،16 الشبكية رابطة الدول المستقلة. ولكن، قبل IPS-RPE يمكن استخدامها علاجيا، وIPS-RPE يجب أن تتسم بدقة. فهم العوامل التي تحكم RPE التمايز ضروري لتحسين المحصول والنقاء من الخلايا لاستخدامها في التطبيقات السريرية.
تمايز الخلايا هي نتيجة لدرجة عالية من التنظيم التعبير الجيني. ويلزم إعادة جينية من الجينوم وتنسيق عوامل النسخ لقرارات مصير الخلية التي تحدث أثناء تمايز والتنمية 17. تنظيم رسالة الحمض النووي الريبي (مرنا) الترجمة من قبل الرنا الميكروي (ميرنا) يقدم حتى الآن مستوى آخر من التنظيم الذي يؤثر على الخلايا مصير 1. MiRNAs قصيرة، ~ 22 الإقليم الشمالي، وأطوال من النيوكليوتيدات التي إما ترجمة قمع من قبلالربط إلى 3 'UTR مرنا أو استهداف مرنا للتدهور. تم الكشف عن MiRNAs في جميع الأنسجة تقريبا وحتى الآن تم تسجيل أكثر من 2،000 microRNAs الإنسان فريدة من نوعها في قاعدة البيانات miRBase. منذ miRNAs تتطلب التكامل الجزئي فقط لربط مرنا الهدف، يمكن ميرنا واحدة يحتمل أن ربط عشرات أو مئات من الأهداف، والعكس بالعكس، أي ومرنا واحدة يمكن أن تكون مستهدفة من قبل العديد من miRNAs مختلفة. هذه الخاصية ملزمة منحل يزيد بشكل كبير من مستوى تعقيد التنظيم وكذلك مستوى صعوبة تحديد وظائف لل miRNAs الفردية ودور كل المسرحيات في الوظائف الخلوية 18-21. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات أن تهذب ميرنا التعبير الجيني أثناء تمايز عن طريق التأثير في الوضع الحامض النووي 17. في دراسة أكثر تحديدا إلى RPE، وقد تبين miR-204/211 لتعزيز النمط الظاهري الظهارية من RPE 22. مجموعة أخرى بتحليل البيانات الشخصية ميرنامن RPE خلال تمايز الخلايا الجذعية الجنينية من وكشفت مجموعات متميزة من ميرنا وأعرب خلال عملية التمايز 23. في الواقع، يمكن تمييز ملامح ميرنا دون لبس أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا ES، خلايا السلائف، وخلايا متباينة عضال 24،25. وأعرب أكثر من 250 miRNAs في شبكية العين. استنادا إلى هذه الدراسات، ونحن نفترض أن miRNAs تلعب دورا هاما خلال تمايز RPE من الجذع.
الهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات للتمايز RPE من IMR90-4 خلايا الجذع، وجمع الحمض النووي الريبي لتحليلها من قبل ميكروأري، وتحليل البيانات ميكروأري لتحديد miRNAs التي أعرب تفاضلي بين ثلاثة أنواع الخلايا، وخلايا الجذع ، IPS-RPE وRPE الجنين. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الثقافات من كل نوع من الخلايا والمهجنة لميكروأري ميرنا، التي تحتوي على تحقيقات محددة ل1،205 miRNAs الإنسان و144 miRNAs الفيروسية. تم مقارنة النتائج ميكروأريد لتحديد التي تم miRNAs وأعرب تفاضلي بين أنواع مختلفة من الخلايا. وقد تم اختيار miRNAs مع 2 أضعاف أضعاف أو أكبر تغيير في التعبير لمزيد من التحليل. تم استخدام برنامج حاسوبي لتحليل ميرنا تحديد أهداف محتملة للmiRNAs وأعرب تفاضلي لتوليد الشبكات الخلوية التي ينظمها miRNAs المحدد.
في الختام، ويصف هذا التقرير والأساليب المستخدمة في الثقافة خلايا الجذع، IPS-RPE، وRPE الجنين. RPE المستمدة من الجذع هي شكليا ووظيفيا مماثلة لRPE الجنين. يعبر عن IPS-RPE أيضا الجينات RPE مميزة بما في ذلك RPE65، CRALBP، PEDF، والانتقال بعيد المدى المحددة 16. لمزيد من تميز هذه الخلايا،…
The authors have nothing to disclose.
الآراء الواردة في هذه الوثيقة أو التأكيدات هي آراء خاصة للكتاب ولا يمكن تفسيره بأنه مسؤول أو كما تعكس آراء زارة الجيش أو وزارة الدفاع.
تم إجراء هذا البحث في حين أن الكتاب يتني A. غرين، ألبرتو مونيز وراميش ر Kaini عقد المجلس الوطني للبحوث ما بعد الدكتوراه البحوث الزمالة في USAISR.
أجريت فحوصات ميكروأري من قبل Greehey طفولة مرفق معهد أبحاث السرطان ميكروأري الأساسية وإدارة المعلوماتية الحيوية في مركز العلوم الصحية UT سان انطونيو.
وأيد هذا العمل من قبل الجيش الأمريكي برنامج السريرية التأهيلية الطب بحوث (CRMRP) وبرنامج بحوث الطب التشغيلية العسكرية (MOMRP).
mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |