세포질 DNA 검출 진학의 자극<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em

요약

프로토콜의 목적은 세포 및 생체 내에서 세포 내 DNA의 촬상 경로를 자극하는 최적의 방법을 사용하는 것이다. 이것은 블런트 엔드 라이 게이션시 긴 이중 가닥 DNA의 생성을 향상시킴으로써 달성된다. 세포 또는 마우스는 지질 형질 감염 시약을 이용하여 형질 전환된다.

초록

효율적 선천성 면역 반응을 자극하기 위해, DNA는 충분한 길이 여야 순도. 우리는 필요한 특성을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 검출 경로가 저렴하고 용이하게 생성 할 수있는 세포 내 DNA를 자극하는 방법을 제시한다. 단, 합성 올리고 뉴클레오티드 (않은 CpG 모티프를 결여한다)의 concatemerization으로 dsDNA는 세포질 DNA 감지 경로를 활성화하기에 충분한 길이로 생성 될 수있다. 이 프로토콜은 효율적인 결찰 발생하기위한 환경을 제공하는 폴리에틸렌 글리콜의 존재 (PEG)의 올리고 뉴클레오티드의 블런트 엔드 라이 게이션을 포함한다. dsDNA concatemers의 표준 프로토콜에 의해 형질 전환 체외에서 선천성 면역 반응을 시뮬레이션하기 위해, 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 정제하여 다음을 사용할 수있다. 이 DNA는 또한 예를 들어, 마우스의 귀에 귓바퀴에 피내 주사함으로써 생체 내에서의 선천성 면역을 자극하는 데 사용될 수있다. 으로concatemerization 프로세스 및 후속 자극 프로토콜을 표준화하고, 선천성 면역계의 신뢰성 및 재현성 활성화가 제조 될 수있다.

서론

DNA는 진핵 생물이 특정 구획 유지 모든 생물 세포의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 구획화가 고장 경우 또는 선천성 면역 시스템의 한 기능을 확인하는 것입니다 이물질은 실제 외부 장벽의 위반을 통해 생물체에 도입 될 때. 인체 올바른 구획화 벗어날 수도 DNA의 소량이 저하 돕기 위해 존재하는 단백질들이있다; DNase의 I, II 및 III는 각각, 플라즈마, 엔도 솜 및 세포질에서 DNA를 분해. 그러나, 선천성 면역 시스템이 추가 핵 DNA에 응답하는지 DNase의 II를 결핍 된 마우스는 제안 인터페론 ^하나의 과도한 생산으로 인한 심한 빈혈 죽는 것이 보였다. 이 응답은 심지어 수신자 같은 수용체 신호 용량을 완전히 결핍 아르 쥐에서 발생합니다. 많은 연구는 지금 인터페론 유전자 (STING) ² TANK 결합 키나제 1 (TB의 자극을 보여 주었다K1) ^3은 세포질에서 DNA의 검출에이 신호 전달 경로는 인터페론 조절 인자 (IRF) -3 ^사를 활성화하는 것이 포함된다. 사이토 카인, 케모카인, 및 인터페론 유전자의 후속 IRF3 의존적 전사가 병원체 또는 위험 관련 분자 패턴 (PAMP 또는 DAMP) ⁽⁵⁾ 중 하나에 대한 선천성 면역 반응의 특징이다.

....

프로토콜

1 Concatemerization

1. 재현 탁 프라이머의 Fw 및 오락 용 차 (RV)은 분자 생물학 학년 H ₂ O에서 10 μg / μL의 농도로 (프라이머 서열 재료의 표 참조) 그런 다음의 Fw의 5 μL와 1.5 ㎖의 microcentrifuge 관에서, 계 프라이머의 5 μl를 섞는다.
2. 15 분 (여기에 설명 된 프라이머 75 ° C) 정확한 열처리 온도에 가열하여 단련 프라이머 믹스. 실온 (RT)에서 냉각 벤치에 둡니다. DDH ₂ O.에 용해하여 배양 중에 60 % PEG8000 준비
3. 60 % PEG8000의 50 μL를 추가 배 폴리 뉴클레오티드 키나제 (PNK) 버퍼, H ₂ O 27 μL 및 프라이머 믹스 PNK 3 μL의 10 μL (30 %의 최종 농도를 달성하기 위해). 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
4. 실온에서 냉각 및 DNA 리가 아제 버퍼의 11 μl를 추가합니다. 그런 다음 DNA 리가 아제의 3 U를 추가하고 밤새 37 ° C에서 배양.

2 DNA 정제및 분석

1. 결찰 믹스의 볼륨을 높이는 H ₂ O의 300 μl를 추가합니다....

결과

아래 결과는 concatemerized DNA가 상대적으로 쉽게 생성 세포와 마우스에서 강력한 선천성 면역 반응을 자극 할 수 있음을 나타낸다. PEG8000의 사용으로, 명확 생성되는 DNA의 길이가 상당히 길어 CXCL10의 전사를 유도 할 수있는 동등 함을 알 수있다. 아가 로즈 겔 분석으로 알 수있는 바와 같이 PEG8000과 샘플, DNA의 길이가 10000 BP (도 1a)을 초과하는 가닥을 포함하는 반면, 표준 concatemerization는 최대 800 염기쌍 (BP)의 DNA의 길이를 갖는다. 쥐의 배아 섬유 아 세포 (MEFs) 또는 마우스로 이들의 DNA의 형질은 선천성 면역 DNA 감지 장치 (그림 1B와 1C)의 자극을 나타내는 qPCR에 의해 측정 할 수있다 사이토 카인과 케모카인의 강력한 전사를 유도한다.

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토론

여기에 설명 된 프로토콜은 세포 유형의 넓은 범위에서와 생체 내에서 재현 가능한 결과와 세포질 선천성 면역 반응을 자극하는 dsDNA를 생성하는 데 사용된다. 사용 된 주 기판 시약 합성 올리고 뉴클레오티드이므로, 다른 DNA 서열 또는 화학적 변형을 이용하여 본 시스템의 유연성이있다. 그것은 예를 들어 형광 라벨 또는 현지화를 추적 또는 다른 생체 분자와의 상호 작용을 평가하기 위해 비오틴 부위를 포함 하나이 프로토콜에서 설명 순방향 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 대체 할 수있다.

DNA의 concatemerization의 주요 이점 중 하나는 시퀀스 제어 할 수있는 방식에서 dsDNA의 긴 가닥의 생산이다. C :이 반응의 생성물은 상업적 RNA 아날로그 폴리 (I 유사한 다른 길이의 DNA (의 혼합물이 항상 있도록 DNA 길이를 정확하게 감시 할 수 없다는 것이다 여기에 제한되지)). 이 방법의 또 다른 장점은 (mg의 양까지) 면역 자극 DNA의 큰 질.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포워드 프라이머	통합 DNA 기술	n/a	TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA
리버스 프라이머	통합 DNA 기술	n/a	TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA
PEG8000	Sigma-Aldrich	P-4463
분자 생물학 등급 물	Sigma-Aldrich	W4502-1L
T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제	Promega	M4101
T4 DNA 리가제	Promega	M1801
페놀 : 클로로포름	피셔 화학	BPE1752p-400
클로로포름	Fisher Chemical	C/4960/PB08
에탄올	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
DNA 젤 로딩 버퍼	New England Biolabs	B7021S
Agarose	Bioline	BIO-41025
Optimem	Life Technologies	11058021
TransIT-LT1	Mirus Bioscience	MIR 2300
Hamilton 주사기	Hamilton	80901 모델 1705
30 G 바늘	BD Bioscience	304000
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
Oligo(dT) 프라이머	Thermo Scientific	SO131
dNTP mix	Fermentas	R0192
Super Script III reverse transcriptase	Life Technologies	56575
첫 번째 가닥 cDNA 합성 버퍼	Life Technologies	y02321
SybrGreen qPCR 빠른 마스터 믹스	Applied Biosystems	4385612
cxcl10 murine forward primer	통합 DNA 기술	n/a	ACTGCATCCATATCGATGAC
cxcl10 쥐 리버스 프라이머	통합 DNA 기술	n/a	TTCATCGTGGCAATGATCTC
il6 쥐 앞선 프라이머	통합 DNA 기술	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC
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