Cerrahi Alma, İzolasyon ve<em> In vitro</em> Doku Mühendisliği Uygulamaları için İnsan Ön Çapraz Bağ-türevli Hücreleri Genişleme
Summary
Ön çapraz bağ (ACL) kısmi gözyaşı onarmak için bir yama olarak gelecek uygulamalar için, insan ACL türetilmiş hücreler, in vitro olarak genişletilebilir ve doku mühendisliği iskeleleri yetiştirilen rekonstrüktif prosedürler sırasında elde edilen dokudan izole edilmiştir. Hücresel yapışma ve morfolojisi sonra iskele yüzeyinde biyouyumluluk onaylamak için yapıldı.
Abstract
ACL yaralanma aktif kişilerde sık karşılaşılan bir sorundur. Fonksiyonu ve istikrarı olumsuz biyomekanik eksiklikler bu eklem içi diz bağ kurşun bile kısmi gözyaşları. Termal modifikasyon, tek paket onarım, tam bir yeniden yapılanma ve yerli ligament hasarlı bölümünün yeniden inşası: kısmi ACL yırtıklarının tedavisi için mevcut seçenekleri konservatif, muhafazakâr yönetimi gibi birden fazla cerrahi seçenekler değişir. Az sayıda çalışma varsa, yönetim sürekli olarak üstün olmak için tek bir yöntem ortaya koymuştur, ve birçok durumda hasta sürekli istikrarsızlık ve diğer komorbi göstermeye devam ediyor.
Bu çalışmanın amacı, kısmen parçalanmış ACL onarımında uygulanabilecek bir doku mühendisliği yama geliştirilmesinde kullanımı için potansiyel bir hücre kaynağı tespit etmektir. Bir yeni protokol Patie türetilen hücre genişlemesi için geliştirilmiştirACL rekonstrüksiyonu geçiren NTS. Hücreleri izole etmek için, ACL yeniden sırasında elde kıyılmış hacl doku, kollajenaz çözelti ile dijeste edilmiştir. Genleşme% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş DMEM/F12 ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Hücreler daha sonra, DMSO, FBS ve genleşme ortamı oluşan bir dondurma ortamı içinde -80 ° C veya sıvı azot içinde depolanmıştır. Çözündükten sonra, hacl türetilmiş hücreler daha sonra bir doku mühendisliği iskelesi, PLAĞA (Poly laktik-ko-glikolik asit) ve kontrol doku kültürü polistiren (TCPS) üzerine ekilmiştir. 7 gün sonra, SEM kontrol TCPS karşı PLAĞA hücresel yapışma karşılaştırmak için gerçekleştirildi. Hücresel morfoloji İmmunofloresans boyama kullanılarak değerlendirildi. SEM (Taramalı Elektron Mikroskobu) mikrograflan hücreleri büyüdü ve PLAĞA ve TCPS yüzeylerde hem yapıştırılır ve 7 gün sonra tüm yüzeyler üzerinde birleştirilebilmeli olduğunu gösterdi. İmmünofloresan boyama, normal olmayan vurguladı morfolojik gösterdiher iki yüzeyde al desen. Bu teknik ACL yenilenme ve yeniden yapılanma uygulamaları için umut verici.
Introduction
Ön çapraz bağ (ACL) diz sık yaralanan eklem içi bağ olduğunu. Yaklaşık 200.000 (ACL) yaralanmaları ABD'de yıllık olarak rapor edilmiştir. Ortopedik rekonstrüktif cerrahi 1,2,3,4 için ACL yaralanması opt yaşayan hastaların% 75 üzerinde. Cerrahi girişim nedeniyle sık sık doğal olarak zayıf iyileşme potansiyeli 3 belirtilir. ACL yeniden tipik olarak bir otogreft veya allogreft tendon vasıtasıyla gerçekleştirilir. Onlar yüksek başarı oranları ve primer sütür onarımı, diğer tedavi seçeneği övünme gibi otogreft ve allogreft rekonstrüksiyonu için altın standardı temsil, 94'e kadar% 5,6,7 başarısızlık oranları göstermiştir.
ACL Kısmi gözyaşları tüm ACL yırtığı 8% 28 10% temsil eder. Prospektif bir çalışmada, Noyes ve ark. Daha ACL yarısından etkileyen kısmi gözyaşları ile hastaların% 50 sonra ACL yetmezliği tamamlamak için olmayan ilerledi tahminoperatif tedavi 9. Diğer çalışmalar kalıcı istikrarsızlığa rapor ve yaralanma öncesi aktivite düzeyi 9,10,11,12,13 dönmek mümkün hastaların az% 30 ile fonksiyonu azalmıştır. Tedavi seçenekleri sınırlıdır ve muhafazakar modaliteleri, kalan ACL termal büzülme ya da ACL rekonstrüksiyon içerir. Son zamanlarda, Augmented primer onarım ilgi artmış oldu. Bu teknikler primer sütür onarımı 14 geliştirmek için biyolojikleri kullanın. Son araştırmalar, mezenkimal gibi hacl, greft sınırlamaları aşmak için 31,32 kök hücreleri elde edilen fakat bu hücrelerin geçerliliği ve etkinliği halen bilinmemektedir hasat için çalıştı. Doku mühendisliği uygulamaları için ideal bir hücre kaynağı hacl fibroblast hücreleri kaynaklı olmayan mesechymal gibi görünüyor.
Mevcut araştırma, uygun bir matris malzeme ve mühendislik iskele için hücre kaynağı belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bu su gibi atılacak bir yırtık ACL için standart bir prosedür olduğunurekonstrüksiyonu ameliyatı sırasında rgical atık, ancak, bu bozuk bağ ACL değiştirme tasarlanmış ideal doku geliştirmek ve artırmak için gerekli hücrelerin edinimi için kaliteli bir kaynak olabilir. Bizim laboratuvar Bu hasat hacl türetilen hücrelerin in vitro genişlemesi için bir protokol geliştirilmiştir. Hacl türetilen hücreler ile aşılanmış bir mühendislik 2D matrisini kullanarak, potansiyel olarak kısmi ACL onarım artırmak ve yırtık ligament güçlendirmek olabilecek bir yama tasarladık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu hACL/2D iskele çalışmanın temel amacı, kısmi ACL yırtığı primer onarım artırmak için bir yama elde edilen hücrelerin kullanımı oldu. Kısmi ACL yırtığı nonoperatif immobilizasyon, korse, ilerici bir rehabilitasyon programı ve düzenli izlem değerlendirme 13,16,17 kısa bir süre içerebilir. Ancak, birçok çalışma sporcular konservatif tedavi kötü sonuçlar ve başarısızlık ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Buckley ve ark. Orta takipte kısmi ACL yırtığı ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar başlangıç fonu ve Southern Illinois Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden cerrahi araştırma hibe bölümünü kabul etmek istiyorum; ve Memorial Tıp Vakfı hibe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri-dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 40C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -800C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 40C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -800C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 40C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -200C |
| goat-anti-mouse antibody (20 Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -200C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -200C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
References
- Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
- Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
- Frank, C. B., Jackson, D. W. The science of reconstruction of the anterior cruciate ligament. J Bone Joint Surg Am. 79, 1556-1576 (1997).
- Miyasaka, K. C., Daniel, D. M., Stone, M. L., Hirshman, P. The incidence of knee ligament injuries in the general population. Am J Knee Surg. 4, 3-8 (1991).
- Taylor, D. C., Posner, M., Curl, W. W., Feagin, J. A. Isolated tears of the anterior cruciate ligament: over 30 year follow-up of patients treated with arthrotomy and primary repair. Am J Sports Med. 37 (1), 65-71 (2009).
- Liljedahl, S. O., Lindvall, N., Wetterfors, J. Early diagnosis and treatment of acute ruptures of the anterior cruciate ligament: a clinical and arthrographic study of forty-eight cases. J Bone Joint Surg Am. 47, 1503-1513 (1965).
- Oensten, M., Lysholdm, J., Gillquist, J. Suture of fresh ruptures of the anterior cruciate ligament: A 5 year follow up. Acta Orthop Scan. 55, 270 (1984).
- Buckley, S. L., Barrack, R. L., Alexander, A. H. The natural history of conservatively treated partial anterior cruciate ligament tears. Am J Sports Med. 17 (2), 221-225 (1989).
- Noyes, F. R., Mooar, L. A., Moorman, C. T., McGinnis, H. G. Partial tears of the anterior cruciate ligament. Progression to complete ligament deficiency. J Bone Joint Surg Br. 71 (5), 825-833 (1989).
- Bak, K., Scavenius, M., Hansen, S., Norring, K., Jensen, K. H., Jorgensen, U. Isolated partial rupture of the anterior cruciate ligament. Long term followup of 56 cases. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (2), 66-71 (1997).
- Fritschy, D., Panoussopoulos, A., Wallensten, R., Peter, R. Can we predict the outcome of a partial rupture of the anterior cruciate ligament? A prospective study of 43 cases. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (1), 2-5 (1997).
- Sommerlath, K., Odensten, M., Lysholm, J. The late course of acute partial anterior cruciate ligament tears. A nine to 15 year follow-up evaluation. Clin Orthop. , 281-2152 (1992).
- Barrack, R. L., Buckley, S. L., Bruckner, J. D., Kneisl, J. S., Alexander, A. H. Partial versus complete acute anterior cruciate ligament tears: the results of nonoperative treatment. J Bone Joint Surg Br. 72 (4), 622-624 (1990).
- Murray, M. M. Current status and potential of primary ACL repair. Clin Sports Med. 28 (1), 51-61 (2009).
- Gupta, A., et al. Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering. J Orthop Res. 9, 1374-1381 (2013).
- Fruensgaard, S., Johannsen, H. V. Incomplete ruptures of the anterior cruciate ligament. J Bone Joint Surg Br. 71, 526-530 (1989).
- Sandberg, R., Balkfors, B., Nilsson, B., Westlin, N. Operative versus non-operative treatment of recent injuries to the ligaments of the knee. A prospective randomized study. J Bone Joint Surg Am. 69, 1120-1126 (1987).
- Lamar, D. S., Bartolozzi, A. R., Freedman, K. B., Nagda, S. H., Fawcett, C. Thermal modification of partial tears of the anterior cruciate ligament. Arthroscopy. 21 (7), 809-814 (2005).
- Indelli, P. F., Dillingham, M. F., Fanton, G. S., Schurman, D. J. Monopolar thermal treatment of symptomatic anterior cruciate ligament instability. Clin Orthop. 407, 138-147 (2003).
- Smith, D. B., Carter, T. R., Johnson, D. H. High failure rate for electrothermal shrinkage of the lax anterior cruciate ligament: a multicenter follow-up past 2 years. Arthroscopy. 24 (6), 637-641 (2008).
- Buda, R., Ferruzzi, A., Vannini, F., Zambelli, L., Di Caprio, F. Augmentation technique with semitendinosus and gracilis tendons in chronic partial lesions of the ACL: clinical and arthrometric analysis. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 14 (11), 1101-1107 (2006).
- Sekiya, J. K., Golladay, G. J., Wojtys, E. M. Autodigestion of a hamstring anterior cruciate ligament autograft following thermal shrinkage: a case report and sentinel of concern. J Bone Joint Surg Am. 82 (10), 1454-1457 (2000).
- Farquharson-Roberts, M. A., Osborne, A. H. Partial rupture of the anterior cruciate ligament of the knee. J Bone Joint Surg Br. 65, 32-34 (1983).
- Rue, J. P., Ghodadra, N., Bach, B. R. Femoral tunnel placement in single-bundle anterior cruciate ligament reconstruction: a cadaveric study relating transtibial lateralized femoral tunnel position to the anteromedial and posterolateral bundle femoral origins of the anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 36, 73-79 (2008).
- Carey, J. L., Dunn, W. R., Dahm, D. L., Zege, S. L., Spindler, K. P. A systematic review of anterior cruciate ligament reconstruction with autograft compared with allograft. J Bone Joint Surg. 91, 2242-2450 (2009).
- Murray, M. M., Martin, S. D., Martin, T. L., Spector, M. Histological changes in the human anterior cruciate ligament after rupture. J Bone Joint Surg Am. 82, 1387-1397 (2000).
- Andrish, J., Holmes, R. Effects of synovial fluid on fibroblasts in tissue culture. Clin Orthop Relat Res. (138), 279-283 (1979).
- Murray, M. M., Spindler, K. P., Ballard, P., et al. Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligamentwith a collagen-platelet-rich plasma scaffold. J Orthop Res. 25, 1007-1017 (2007).
- Carter, T. R. Anterior cruciate ligament thermal shrinkage. Clin Sports Med. 21, 693-700 (2002).
- Perry, J. J., Higgins, L. D. Anterior and posterior cruciate ligament rupture after thermal treatment. Arthroscopy. 16, 732-736 (2000).
- Cheng, M. T., Yang, H. W., Chen, T. H., Lee, O. K. Isolation and characterization of multipotent stem cells from human cruciate ligaments. Cell Prolif. 42 (4), 448-460 (2009).
- Matsumoto, T., et al. Isolation and characterization of human anterior cruciate ligament-derived vascular stem cells. Stem Cells Dev. 21 (6), 859-872 (2012).
