EPR kofaktörleridir Redox Titrasyonu İzlenen<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Nar1
Summary
The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.
Abstract
Elektron Paramagnetik Rezonans (EPR) redoks titrasyonları güçlü bir yöntem proteinlerde kofaktörlerinin orta noktası potansiyelini belirlemek ve onların saptanabilir redoks devlet kofaktör tespit ve ölçmek için vardır izledi.
teknik, elektron transfer oranları hakkında bilgi sunmuyor gibi, yaklaşımlar, ancak çalışılan protein kofaktör kimliği ve redoks devlet kurmak yok, doğrudan elektrokimya (voltametri) tamamlayıcı. tekniği bir elektron paramanyetik rezonans (EPR) tespit kofaktör içeren herhangi bir proteine yaygın olarak uygulanmaktadır.
Tipik bir titrasyon 1-100 uM aralığındaki bir kofaktör konsantrasyonu ile 2 ml protein gerektirir. proteinin belirli bir potansiyelde örnek poise için bir kimyasal indirgeyici (sodyum ditionit) veya oksidanın (potasyum ferrisiyanür) ile titre edilmiştir. Bir platin tel ve bir Ag / AgCl referans elektrot volt bağlımetre protein çözeltisi potansiyelini ölçmek için. 13 birçok farklı redoks mediatörü bir dizi protein redoks kofaktörler ve elektrotlar arasındaki denge için kullanılır. Numuneler protein farklı redoks kofaktörler için karakteristik farklı potansiyelleri ve Elektron paramanyetik rezonans spektrumları, çizilir ölçülür. Örnek potansiyeli karşı sinyal yoğunluğu arsa kofaktör orta noktası potansiyelini belirlemek amacıyla Nernst denklemi kullanılarak analiz edilir.
Introduction
Bu gezegen, fotosentez, azot fiksasyonu ve solunum hayat sürdürme en temel kimyasal işlemler, organik ve inorganik redoks cofactors geniş bir yelpazede içeren büyük protein kompleksleri tarafından katalize edilir dikkat çekicidir. Tüm proteinlerin yaklaşık% 30 bir veya daha fazla metal kofaktörlerine içerdiğini tahmin edilmiştir. 1,2 belirlenmesi ve redoks kofaktör doğrudan elektrokimya (örneğin, protein filmi voltametri) veya redoks titrasyonlarını kullanılarak oluşturulabilir karakterize. İki teknikleri doğaları ve uygulanabilirliği tamamlayıcısıdır. Voltammetri bir elektrot yüzeyi ile reaksiyona girebilen orta potansiyelleri ve kofaktör elektron transferi kinetik hızlı belirlenmesi sunmaktadır. 3,4 Genellikle bu tür sitokrom-c veya ferrodoksin olarak elektron transfer proteinlerinin için iyi çalışır. Ve bazen bir elektrod yüzeyinde immobilize edilmiştir, daha karmaşık proteinler için de kullanılabilir. Detaylı bilgiprotein kofaktör doğası voltogramda kofaktör kimliğine ilişkin herhangi bir doğrudan bilgi vermez gibi, mevcut olmak zorundadır. Redoks titrasyonları yürütmek için daha zahmetli ve protein mg miktarlarda gerektirir. Ancak, orta potansiyeli ve kofaktör kimliği hakkında bilgi sunuyoruz. 5 Ayrıca, bir proteinin birden kofaktör izlenebilir bir tek Titrasyonda.
Bir redoks titrasyonu prensibi redoks aktif protein veya enzim kimyasal azaltılmış ya da oksitlenmiş olmasıdır. Amacıyla kofaktör kullanılan indirgeyici veya oksidan redoks arabulucular ile reaksiyona emin olmak için. Bu redoks mediatörleri, çözeltiye potansiyel ölçülebilir şekilde bir elektrot ile reaksiyona girer. Arabulucular bir redoks tampon olarak hareket ve protein ve elektrot cofactors arasında dengeye. Kimyasal olarak, istenen değere potansiyel poising sonra, bir numune aw için sıvı azot içinde dondurulmuş hızlı bir şekilde çekilir vespektroskopik teknikleri ile daha fazla analiz AIT. EPR spektroskopisi bu miktar para-manyetik metal merkezi ya da organik radikalleri ölçmek için kullanılabilir bu açıdan özellikle yararlıdır.
titrasyon iki yönde gerçekleştirilebilir: düşük yüksek ya da düşük yüksek orta olasılığı vardır. seçim çalışmanın altında kofaktörlerinin istikrar bağlıdır. Genellikle düşük potansiyelde başlayacak ve potansiyelini artırmak aşamalı oksidan eklemek akıllıca olacaktır. Bu oksidatif titrasyon denir ve burada tarif edilir. Burada Saccharomyces cerevisiae protein Nar1 içeren demir-sülfür küme redoks titrasyonu göstermektedir. Bu protein sitozolik demir-sülfür küme biyosentetik makineleri (CIA yolu) olarak, bir iskele protein olarak, büyük olasılıkla yer almaktadır. 6,7
Protocol
Representative Results
Discussion
13 redoks mediatör dizisi -0,45 gelen SHE karşı 0,3 V (Tablo 1 ve Şekil 3) aralığında çözelti içinde bir redoks denge sağlar. Peki yukarıda ve bu potansiyellerin altındaki tüm arabulucular ya tamamen azalır veya tamamen okside ve dolayısıyla protein redoks aktif merkezleri ile daha fazla dengeleme oluşabilir edilmektedir. Bazen redoks titrasyonları sadece dar bir aralık 11 ölçülecek izin, sadece iki ya da üç aracılarla gerçekleştirilen literatürde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser mali Kimyasal Tasarım (NRSC-Kataliz) tarafından Kontrollü Hollanda Ulusal Araştırma Okulu Kombinasyon, Catalysis bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Dr HY Steensma ve Leiden Üniversitesi'nden Dr. GPH van Heusden S. rekombinant ifadesi ile desteklerinden dolayı kabul edilir S. cerevisiae Nar1.
Materials
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) ·(HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
- Lippard, S. J., Berg, J. M. . Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).
- Bertini, I. . Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. 생화학. 42, 8653-8662 (2003).
- Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
- Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
- Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
- Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
- Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
- Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
- Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene – a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
- Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. 생화학. 31, 10331-10337 (1992).
- Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
- Tadesse, M. A., D’Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).
