Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti
Summary
Una tecnica per isolare colangiociti dai dotti biliari extraepatici di topi neonati è descritto. I condotti sono meticolosamente sezionato, e poi le cellule sono isolate da escrescenza in gel di collagene di spessore. Questo metodo fornisce un utile strumento per lo studio dello sviluppo del dotto biliare extraepatico e patologia.
Abstract
I dotti biliari intra ed extraepatici del fegato sono evolutivamente distinti, e possono essere differenzialmente influenzati da certe malattie. Tuttavia, le differenze tra colangiociti intra ed extra, e tra le cellule neonatali e adulte, non sono ben compresi.
Metodi per l'isolamento di colangiociti da dotti biliari intraepatici sono ben stabiliti 1-4. Isolamento di cellule duttali extraepatici, specialmente dal neonato, non è ancora stato descritto, anche se questo sarebbe di grande beneficio per comprendere le differenze fra le popolazioni colangiociti distinte e nello studio malattie come atresia biliare che sembrano indirizzare i dotti extraepatici. Qui descritto è una tecnica ottimizzata per isolare le cellule dei dotti biliari extraepatici sia neonatali e topo adulto. Questa tecnica produce una popolazione pura di cellule con contaminazioni minimo da cellule mesenchimali come fibroblasti.
Questa metodologiad è basato sulla rimozione dei dotti extraepatici e cistifellea, seguita da dissezione meticolosa e raschiatura per rimuovere strati di grasso e fibroblasti. Le strutture sono incorporati in spessi strati di collagene e coltivate per circa 3 settimane per consentire conseguenza di colangiociti in monostrati, che possono poi essere tripsinizzato e ri placcato per uso sperimentale.
Introduction
L'origine e lo sviluppo dei colangiociti intra ed extra sono nettamente diverse. Il fegato si sviluppa da un diverticolo della ventrale foregut endoderma 5. La regione caudale del diverticolo forma dell'albero biliare extraepatico, mentre la regione craniale genera l'albero biliare intraepatico 5. Colangiociti dei dotti intraepatici sono derivati da cellule progenitrici intorno alla piastra duttale in peri regioni portale 6. Queste cellule hanno la capacità di differenziarsi in epatociti o colangiociti sia 6. Ciò ha importanti implicazioni cliniche dato che cholangiopathies possono rivolgono specificamente una categoria di colangiociti. Ad esempio, l'atresia biliare colpisce inizialmente i dotti extraepatici del neonato, mentre la sindrome di Alagille colpisce dotti intraepatici.
Ci sono diverse descrizioni di isolamento delle colangiociti intraepatici e unità del dotto biliare da topi e ratti. Investigators hanno isolato cellule singole dall'isolamento condotto e la successiva escrescenza, o dalla digestione fegato e anticorpo abbattere di colangiociti esprimono specifici marcatori di superficie delle cellule 1-4. Unità del dotto biliare funzionali e polarizzati sono stati isolati mediante digestione fegato e dimensioni filtrazione 7. Unità dotto biliare sono in grado di rispondere alle secretoria stimoli e dimostrare la secrezione di fluidi 7, mentre colangiociti isolati hanno dimostrato di sviluppare strutture duttulare in vitro 1,2. Limitazioni di questi metodi includono la necessità di competenze tecnico specializzato e attrezzature speciali per la perfusione del fegato con enzimi digestivi. Inoltre, vi è il rischio di contaminazione con cellule mesenchimali 3.
Un metodo per isolare colangiociti dei dotti biliari extraepatiche, in particolare da dotti biliari extraepatici neonatale, non è stato descritto in precedenza. Il documento illustra una tecnica semplificata per isolare neonatale uns così come le cellule adulte dotti biliari extraepatici ad alti livelli di purezza. Questa tecnica faciliterà lo studio delle differenze tra colangiociti e ricerche sui meccanismi di malattie come l'atresia biliare che coinvolgono i dotti extraepatici intra ed extraepatiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descritto è una tecnica per isolare colangiociti puri dai dotti biliari extraepatici di topi di topi di tutte le età, compresi i neonati. La tecnica offre il vantaggio che colangiociti extraepatici possono essere studiate separatamente da colangiociti intraepatiche, e può facilitare studi per individuare le differenze principali tra queste popolazioni di cellule. Abbiamo recentemente pubblicato una dimostrazione studio diminuito ciglia in colangiociti extraepatiche isolato con questo metodo e con infezione da rot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati per la Patologia Molecolare e Imaging Core del UPenn NIDDK Centro Studi molecolari in Digestiva e Malattie del Fegato (P30 DK50306) per l'assistenza con l'imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01 DK-092111) e dalla Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW) e da una borsa di studio dalla Liver Disease Research and Education Network infanzia (SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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