Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes
Summary
Une technique pour isoler cholangiocytes des voies biliaires extra-hépatiques de souris néonatale est décrite. Les conduits sont méticuleusement disséqués, puis les cellules sont isolées par l'excroissance dans des gels de collagène épaisses. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier extrahépatique bile développement conduit et la pathologie.
Abstract
Les canaux biliaires intra et extra-hépatiques du foie sont distincts de développement, et peuvent être affectés différemment par certaines maladies. Toutefois, les différences entre cholangiocytes intra et extra-hépatiques, et entre les cellules néonatales et adultes, ne sont pas bien comprises.
Méthodes pour l'isolement de cholangiocytes de canaux biliaires intra-hépatiques sont bien établis 1-4. Isolement de cellules canalaires extra-hépatiques, en particulier du nouveau-né, n'a pas encore été décrit, bien que ce serait d'une grande utilité dans la compréhension des différences entre les populations de cholangiocytes distinctes et dans l'étude des maladies telles que l'atrésie biliaire qui semblent cibler les canaux extra-hépatiques. Décrit ici est une technique optimisée pour isoler les cellules des voies biliaires extra-hépatiques deux nouveau-nés et de la souris adulte. Cette technique donne une population de cellules avec une contamination minimale pur à partir de cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes.
Cette méthod est basé sur l'enlèvement des canaux extra-hépatiques et de la vésicule biliaire, suivie par une dissection minutieuse et gratter pour enlever les couches de graisse et des fibroblastes. Les structures sont noyées dans des couches épaisses de collagène et cultivées pendant 3 semaines environ pour permettre excroissance de cholangiocytes en monocouches, qui peuvent ensuite être traitées à la trypsine et étalées re pour une utilisation expérimentale.
Introduction
L'origine et le développement de cholangiocytes intra et extra-hépatiques sont nettement différents. Le foie se développe à partir d'un diverticule de l'intestin antérieur endoderme ventral 5. La région caudale du diverticule forme l'arbre biliaire extra-hépatique, tandis que la région crânienne génère l'arbre biliaire intrahépatique 5. Cholangiocytes de conduits intrahépatiques sont dérivées de cellules progénitrices autour de la plaque canalaire dans les régions péri portail 6. Ces cellules ont la capacité de se différencier en hépatocytes ou soit des cholangiocytes 6. Cela a d'importantes implications cliniques étant donné que cholangiopathies peuvent cibler spécifiquement une catégorie de cholangiocytes. Par exemple, l'atrésie biliaire affecte d'abord les canaux extra-hépatiques du nouveau-né, alors que le syndrome d'Alagille affecte voies biliaires intrahépatiques.
Il existe des descriptions multiples de l'isolement des cholangiocytes intra-hépatiques et les unités de la voie biliaire à partir des souris et des rats. Dansinvestigateurs ont isolé des cellules individuelles par l'isolement de la gaine et l'excroissance subséquente, ou par digestion du foie et de la tirer vers le bas anticorps cholangiocytes exprimant des marqueurs de surface cellulaire spécifiques 4.1. Les unités des canaux biliaires fonctionnels et polarisés ont été isolées par digestion du foie et de la filtration de la taille 7. Biliaires unités de conduits sont capables de répondre à des stimuli de sécrétion et de démontrer la sécrétion de liquide 7, tandis que il a été démontré cholangiocytes isolés à développer des structures canalaire in vitro 1,2. Limites de ces méthodes comprennent la nécessité d'une expertise technique spécialisée et un équipement spécial pour la perfusion du foie avec des enzymes digestives. En outre, il existe un risque de contamination par des cellules mésenchymateuses 3.
Procédé pour isoler extrahépatiques cholangiocytes des canaux biliaires, en particulier de voies biliaires extra-hépatiques néonatales, n'a pas été précédemment décrit. Le présent document décrit une technique simplifiée pour isoler un nouveau-nés ainsi que des cellules des canaux biliaires extra-hépatiques adultes à des niveaux élevés de pureté. Cette technique facilitera l'étude des différences entre cholangiocytes et la recherche sur les mécanismes des maladies comme atrésie des voies biliaires qui impliquent les conduits extra-hépatiques et extra-hépatiques intra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décrite ici est une technique pour isoler cholangiocytes pures à partir des voies biliaires extra-hépatiques de souris de souris de tous les âges, y compris les nouveau-nés. La technique offre l'avantage que cholangiocytes extra-hépatiques peuvent être étudiés séparément cholangiocytes intra-hépatiques, et peut faciliter les études pour identifier les principales différences entre ces populations de cellules. Nous avons récemment publié une étude démontrant diminué cils dans cholangiocytes extra-h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants à la pathologie moléculaire et imagerie de base du Centre NIDDK UPenn d'études moléculaires dans des maladies digestives et hépatiques (P30 DK50306) pour l'aide à l'imagerie. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (R01 DK-092111) et de Fred et Suzanne Biesecker pédiatrique foie Center (à PBE) et par une bourse de recherche sur les maladies du foie et de l'éducation de la petite enfance réseau (à SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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