新生児肝外胆管細胞を単離する
Summary
新生仔マウスの肝臓外胆管から胆管を単離するための技術が記載されている。ダクトは細心の注意を払って解剖し、その後、細胞が厚いコラーゲンゲル中で成長することによって単離される。この方法では、肝外胆管の開発および病理学を研究するための有用なツールを提供しています。
Abstract
肝内および肝外胆管は、発生的に区別され、かつ差次特定の疾患によって影響を受ける可能性がある。しかし、内および肝外胆管、および新生児と成人細胞との間の相違点は、よく理解されていない。
肝内胆管から胆管細胞を単離するための方法は当1-4確立されている。これは明確な胆管集団間および肝外ダクトをターゲットに表示されるような胆道閉鎖症などの疾患を研究の違いを理解する上で非常に有益であるが、特に新生児の肝外管細胞の単離は、まだ記載されていない。ここで説明は、新生児および成人の両方のマウス肝臓外胆管細胞を単離するための最適化技術である。この手法は、線維芽細胞のような間葉系細胞から、最小限の汚染との純粋な細胞集団が得られます。
このメトDは、肝臓外管および胆嚢の除去に基づいて細心の解剖が続き、脂肪や線維芽細胞層を除去するスクレーピングされている。構造は、その後、トリプシン処理することができ、実験的な使用のためにメッキを再単層、内胆管の伸長を可能にするために約3週間のコラーゲン培養の厚い層に埋め込まれている。
Introduction
内および肝外胆管の起源と発展は著しく異なっている。肝臓は、腹側前腸内胚葉5の憩室から開発しています。頭蓋領域は肝内胆管5を生成しながら、憩の尾側領域は、肝外胆管を形成している。肝内胆管、ダクトは、ポータル周囲領域6に、管板の周囲に前駆細胞に由来する。これらの細胞は、肝細胞または胆管6のいずれかに分化する能力を有する。これはcholangiopathiesは、特に胆管の1カテゴリを標的にすることができることを考えると重要な臨床的意義を持っています。アラジール症候群は肝内管に影響を与えながら、例えば、胆道閉鎖症は、最初は、新生児の肝臓外管に影響を与えます。
マウスおよびラットの肝内胆管や胆管ユニットの単離の複数の記述がある。でvestigatorsは、ダクトの単離およびその後の伸長によって、または特定の細胞表面マーカーを発現している胆管1-4のダウン肝臓消化および抗体プルで単一細胞を単離した。官能偏胆管ユニットは、肝臓消化およびサイズ濾過7によって単離されている。胆管ユニットは、単離された胆管細胞は、インビトロで 1,2小管構造を開発することが示されているが、刺激して分泌液分泌7を実証するために応答することができる。これらの方法の制限は、消化酵素で、肝臓灌流のための専門的な技術的専門知識や特殊な装置の必要性があります。また、間葉系細胞3による汚染の危険性がある。
具体的には新生児肝外胆管から、肝外胆管胆管を単離する方法は、以前に記載されていない。本論文では、新生児Aを分離するために簡略化された手法の概要を説明純度の高いレベルで成人肝外胆管細胞として周知だ。この手法は、内および肝外胆管と肝外ダクトを伴う胆道閉鎖症などの病気のメカニズムの研究の違いの研究を促進する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するには、新生児を含むすべての年齢のマウスのマウスの肝外胆管、胆管から純粋に分離する技術である。技術は肝外胆管は、肝内胆管から別々に研究することができるという利点を提供しており、細胞のこれらの集団の主な違いを識別するための研究を容易にすることができる。我々は最近、この方法によって単離された肝外胆管に繊毛が減少し、アカゲザルロタウイルス8<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、消化器の分子研究UPenn NIDDKセンターの分子病理学とイメージングコアおよびイメージングの支援のための肝臓病（p30ポリDK50306）に感謝しています。この作品は、国立衛生研究所からの補助金（R01 DK-092111）によってサポートされ、フレッドとスザンヌBiesecker小児肝センター（RGW）と（SK）は小児肝疾患研究教育ネットワークの交わりによって行った。
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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