신생아 간외 Cholangiocytes의 분리
Summary
신생아 생쥐의 간외 담관에서 cholangiocytes을 분리하는 기술을 설명한다. 덕트 꼼꼼하게 해부 한 다음 세포는 두꺼운 콜라겐 젤의 부산물에 의해 격리됩니다. 이 방법은 간외 담관 개발 및 병리 공부를위한 유용한 도구를 제공합니다.
Abstract
간 인트라 및 간외 담관이 발달 별개이며, 차동 특정 질환에 의해 영향을받을 수있다. 그러나, 내부 및 간외 cholangiocytes, 신생아와 성인 세포 사이의 차이가 잘 이해되지 않습니다.
간내 담관에서 cholangiocytes의 분리를위한 방법은 잘 1-4 설정됩니다. 이 별개의 cholangiocyte 집단 간의 차이를 이해하고, 간외 덕트를 대상으로 이와 같은 담도 폐쇄증과 같은 질병을 공부에 큰 도움이 될 것이지만, 특히 신생아에서 간외 유관 세포의 분리, 아직 설명되지 않았습니다. 신생아 및 성인 마우스 양쪽 간외 담관 세포를 분리하기 위해 최적화 된 기술은 여기에서 설명한다. 이 기술은 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포에서 최소한의 오염과 순수한 세포 인구를 산출한다.
이 메 톡시D는 철저한 해부와 지방과 섬유 아세포 층을 제거하는 긁기 다음 간외 덕트 및 담낭의 제거를 기반으로합니다. 구조는 실험적인 사용을 위해 다음 트립신 될 수 있으며, 도금 재 단층에 cholangiocytes의 파생물을 할 수 있도록 약 3 주 동안 콜라겐 배양의 두꺼운 층에 포함됩니다.
Introduction
내부 및 간외 cholangiocytes의 기원과 발전은 현저하게 다르다. 간은 복부 foregut의 내배엽 5 게실에서 개발하고 있습니다. 뇌 영역은 간내 담도 나무 5를 생성하는 동안 게실의 꼬리 영역은 간외 담도 트리를 형성한다. 간내 덕트 cholangiocytes는 요정 포털 지역 6 유관 플레이트 주변의 전구 세포에서 파생됩니다. 이러한 세포는 간세포 또는 cholangiocytes 6 하나로 분화 할 수있는 능력이있다. 이 cholangiopathies 특별히 cholangiocytes의 하나의 카테고리를 타겟팅 할 수 있습니다 주어진 중요한 임상 적 의미를 가지고 있습니다. Alagille 증후군은 간내 덕트에 영향을 미치는 예를 들어, 담도 폐쇄증은 처음, 신생아의 간외 덕트에 영향을 미칩니다.
마우스 및 래트에서의 간내 cholangiocytes 및 담관 유닛 절연 다중 디스크립션이있다. 에vestigators 덕트 분리 이후의 부산물에 의해 하나의 세포를 고립, 또는 간 소화 항체에 의해 특정 세포 표면 마커 1-4을 표현 cholangiocytes의 풀다운있다. 기능 및 편광 담관 단위 간 소화 크기 여과 (7)에 의해 고립되었다. 담관 유닛 절연 cholangiocytes 시험관 1,2 ductular 구조를 개발하기 위해 도시되었지만, 자극을 분비하고 분비 유체 7을 설명하기 위해 응답 할 수있다. 이러한 방법의 제한은 소화 효소와 간 관류에 대한 전문 기술 전문 지식과 특별한 장비의 필요성이 (가) 있습니다. 또, 간엽 세포 3 오염의 위험이있다.
구체적 신생아 간외 담관에서 간외 담관 cholangiocytes를 분리 방법은 상술되지 않았다. 이 논문은 신생아를 격리 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다잘 순도 높은 수준의 성인 간외 담관 세포로의. 이 기술은 내부 및 간외 cholangiocytes과 간외 덕트를 포함 담도 폐쇄증과 같은 질병의 메커니즘에 대한 연구 사이의 차이에 대한 연구를 촉진 할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명하는 것은 신생아를 포함한 모든 연령대의 마우스 마우스의 간외 담관에서 순수한 cholangiocytes을 분리하는 기술이다. 기술 간외 cholangiocytes은 간내 cholangiocytes 별도로 연구 될 수 있다는 장점을 제공하고, 이러한 세포의 집단 사이의 주요 차이점을 확인하는 연구를 용이하게 할 수있다. 우리는 최근하다는 연구가이 방법에 의해 고립 된 붉은 털 로타 바이러스 8에 감염 간외 chola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 소화 분자 연구 UPENN NIDDK 센터의 분자 병리 및 이미징 코어 및 이미징에 대한 지원은 간 질환 (P30의 DK50306)에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (RGW에) 건강의 국립 연구소 (R01 DK-092111)에서와 프레드 수잔 Biesecker 소아 간 센터에서 교부금에 의해 및 (SK에) 어린 시절 간 질환 연구 및 교육 네트워크에서 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
