Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes
Summary
Uma técnica para isolar cholangiocytes das vias biliares extra-hepáticos de ratos neonatais é descrito. As condutas são meticulosamente dissecados, e, em seguida, as células são isoladas por crescimento em géis de colagénio espessas. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento do ducto biliar extra-hepática e patologia.
Abstract
Os ductos biliares intra e extra-hepáticos do fígado são developmentally distinta, e podem ser diferencialmente afectada por certas doenças. No entanto, as diferenças entre intra e extra-hepáticos cholangiocytes, e entre as células recém-nascidos e adultos, não são bem compreendidos.
Os métodos para o isolamento de cholangiocytes de ductos biliares são bem estabelecida 1-4. Isolamento de células ductais extra-hepáticos, particularmente a partir do neonato, ainda não foi descrito, embora este seria de grande benefício para a compreensão das diferenças entre as populações distintas cholangiocyte e no estudo de doenças tais como a atresia biliar que aparecem para atingir os canais extra-hepáticos. Descrito aqui é uma técnica otimizada para isolar as células dos ductos biliares extra-hepáticas, tanto neonatal e adulto do rato. Esta técnica produz uma população de células pura com contaminação mínima entre as células mesenquimais como fibroblastos.
Este metodod é baseado na remoção dos ductos extra-hepáticos e da vesícula biliar, seguida por dissecação meticulosa e raspagem para remover as camadas de gordura e de fibroblastos. As estruturas são incorporados em camadas de espessura de colagénio e cultivadas durante aproximadamente 3 semanas para permitir o crescimento de cholangiocytes em monocamadas, que pode, então, ser tratadas com tripsina e re-plaqueadas para o uso experimental.
Introduction
A origem eo desenvolvimento da intra e extra-hepáticos cholangiocytes são marcadamente diferentes. O fígado se desenvolve a partir de um divertículo do intestino anterior endoderme ventral 5. A região caudal do divertículo forma a árvore biliar extra-hepática, enquanto que a região craniana gera a árvore biliar intra-hepática 5. Cholangiocytes duto intra-hepática são derivadas de células progenitoras em torno da placa ductal nas regiões peri portal 6. Estas células têm a capacidade de se diferenciar em qualquer hepatócitos ou cholangiocytes 6. Isto tem implicações clínicas significativas, dado que cholangiopathies podem objetivar especificamente uma categoria de cholangiocytes. Por exemplo, atresia biliar afeta inicialmente os ductos extra-hepáticos do recém-nascido, enquanto a Síndrome de Alagille afeta ductos intra-hepáticos.
Há várias descrições do isolamento de cholangiocytes intra e unidades biliares de camundongos e ratos. Emvestigators isolaram células individuais pelo isolamento do duto e conseqüência subseqüente, ou por digestão do fígado e do anticorpo puxar para baixo de cholangiocytes expressam marcadores de superfície celular específicos 1-4. Unidades biliares funcionais e polarizadas foram isoladas por digestão do fígado e tamanho filtração 7. Unidades de ductos biliares são capazes de responder a estímulos secretora e demonstram a secreção de fluido 7, ao passo que cholangiocytes isolados têm sido mostrados para desenvolver estruturas ductulares in vitro 1,2. Limitações destes métodos incluem a necessidade de conhecimento técnico especializado e equipamento especial para perfusão de fígado com enzimas digestivas. Além disso, existe o risco de contaminação com células mesenquimais 3.
Um método para isolar extra-hepáticos cholangiocytes do ducto biliar, especificamente a partir das vias biliares extra-hepáticos neonatal, não foi anteriormente descrito. Este artigo descreve uma técnica simplificada para isolar um neonatalé bem como as células dos ductos biliares extra-hepáticos adultos em altos níveis de pureza. Esta técnica irá facilitar o estudo das diferenças entre cholangiocytes e pesquisas sobre mecanismos de doenças como atresia biliar que envolvem os ductos extra-hepáticos e extra-hepáticos intra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito aqui é uma técnica para isolar cholangiocytes puros das vias biliares extra-hepáticas de ratos de ratos de todas as idades, incluindo recém-nascidos. A técnica oferece a vantagem de que cholangiocytes extra-hepáticas podem ser estudadas separadamente cholangiocytes intra-hepática, e pode facilitar a estudos para identificar as principais diferenças entre estas populações de células. Publicamos recentemente um estudo demonstrando diminuição cílios em cholangiocytes extra-hepáticos isolados por est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Patologia Molecular e Imagem Núcleo do Centro de NIDDK UPenn para estudos moleculares em Doenças Digestivas e do Fígado (P30 DK50306) para assistência com imagens. Este trabalho foi financiado por concessões do National Institutes of Health (R01 DK-092111) e do Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (para RGW) e por uma bolsa da Liver Disease Research e Rede de Educação Infantil (a SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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