Выделение новорожденных внепеченочных холангиоцитах
Summary
Техника для изоляции холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков у новорожденных мышей описан. Воздуховоды являются тщательно препарировали, а затем клетки выделяют выроста в толстых гелей коллагена. Этот метод является полезным инструментом для изучения внепеченочных развитие протоков желчи и патологии.
Abstract
Интра и внепеченочных желчных протоках печени являются умственно различны, и может быть по-разному влияет на некоторых заболеваний. Тем не менее, различия между внутри-и внепеченочных холангиоцитах, а также между новорожденных и взрослых клеток, не до конца понятны.
Методы выделения холангиоцитах из внутрипеченочных желчных протоков, хорошо известны 1-4. Выделение внепеченочных протоков клеток, особенно из новорожденных, до сих пор не описано, хотя это было бы весьма полезным для понимания различия между различными популяциями cholangiocyte и в изучении таких заболеваний, как атрезия желчных путей, которые появляются целевой внепеченочных протоков. Описанный здесь является оптимизированная методика изолировать оба новорожденных и взрослых мышей внепеченочные клетки желчных протоков. Этот метод дает чистую популяцию клеток с минимальными загрязнения от мезенхимальных клеток, как фибробласты.
Это метод основан на удалении внепеченочных протоков и желчного пузыря, а затем тщательного вскрытия и выскабливание, чтобы удалить жир и фибробластов слоев. Структуры встроены в толстых слоев коллагена и культивировали в течение приблизительно 3 недель, чтобы разрастание холангиоцитах в монослоев, которые затем могут быть трипсином и повторно высевали для экспериментального использования.
Introduction
Происхождение и развитие внутри-и внепеченочных холангиоцитах заметно отличаются. Печень развивается из выпячивания вентральной энтодермы передней кишки 5. Хвостовой область дивертикула формирует внепеченочных желчных дерево, в то время как черепная область генерирует внутрипеченочный желчный дерево 5. Внутрипеченочные холангиоцитов воздуховодов выводятся из клеток-предшественников вокруг протоков пластины в пригородных портала регионах 6. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в либо гепатоцитов или холангиоцитах 6. Это имеет значительные клинические последствия, учитывая, что cholangiopathies может специально направлены одну категорию холангиоцитах. Например, атрезия желчных путей изначально влияет на внепеченочные протоки новорожденных, в то время как Alagille синдром влияет внутрипеченочные протоки.
Есть несколько описаний изоляции внутрипеченочных холангиоцитах и желчных протоков единиц от мышей и крыс. Вvestigators выделили отдельные клетки путем выделения канала и последующего вырост, или путем расщепления печени и антитела снести холангиоцитов выражающих конкретные маркеры клеточной поверхности, 1-4. Функциональные и поляризованные единиц желчных протоков были выделены расщеплением печени и размера фильтрации 7. Желчных протоков единиц способны реагировать на секреторные стимулы и продемонстрировать жидкости секрецию 7, в то время как изолированные холангиоцитов было показано, что развитие протоками структур в пробирке 1,2. Ограничения этих методов включают необходимость специализированной технической экспертизы и специального оборудования для перфузии печени с пищеварительными ферментами. Кроме того, существует риск загрязнения с мезенхимальных клеток 3.
Способ изолировать внепеченочные холангиоцитах желчных протоков, в частности, из новорожденных внепеченочных желчных протоков, ранее не была описана. В этом документе излагаются упрощенную технику, чтобы изолировать новорожденных Aы также взрослых внепеченочных желчных протоков клеток при высоких уровней чистоты. Этот метод будет способствовать изучение различий между внутри-и внепеченочных холангиоцитах и исследований в области механизмов болезней, как атрезия желчных путей, которые включают внепеченочных протоков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод, чтобы изолировать чистые холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков мышей мышей всех возрастов, в том числе новорожденных. Методика имеет то преимущество, что внепеченочных холангиоцитов можно изучать отдельно от внутрипеченочных холангиоцитах, и может о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны молекулярной патологии и обработки изображений ядро UPenn NIDDK Центра молекулярных исследований в желудочно-кишечных и заболеваний печени (P30 DK50306) об оказании помощи визуализации. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья (R01 DK-092111) и от Фреда и Сюзанны Biesecker детской печени Центра (до RGW) и стипендией с детства Заболевания печени исследований и образования сети (к SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
