Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes
Summary
Una técnica para aislar cholangiocytes de los conductos biliares extrahepáticos de ratones recién nacidos se describe. Los conductos están meticulosamente disecados, y luego las células se aíslan por consecuencia en geles de colágeno gruesas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del desarrollo de vías biliares extrahepáticas y patología.
Abstract
Los conductos biliares intra y extrahepáticas del hígado son de desarrollo distinta, y puede ser diversamente afectados por ciertas enfermedades. Sin embargo, las diferencias entre cholangiocytes intra y extrahepáticas, y entre las células neonatales y de adultos, no están bien entendidas.
Los métodos para el aislamiento de cholangiocytes de conductos biliares intrahepáticos están bien establecidos 1-4. Aislamiento de células ductales extrahepáticos, especialmente desde el recién nacido, todavía no se ha descrito, aunque esto sería de gran beneficio en la comprensión de las diferencias entre las poblaciones cholangiocyte distintos y en el estudio de enfermedades tales como la atresia biliar que aparecen para apuntar a los conductos extrahepáticos. Se describe aquí es una técnica optimizada para aislar las células de las vías biliares extrahepáticas, tanto neonatal y del adulto del ratón. Esta técnica permite obtener una población de células puro con un mínimo de contaminación de las células mesenquimales como los fibroblastos.
Esta metod se basa en la eliminación de los conductos y de la vesícula biliar extrahepática, seguida de la disección meticulosa y raspado para remover capas de grasa y fibroblastos. Estructuras están incrustadas en capas gruesas de colágeno y se cultivaron durante aproximadamente 3 semanas para permitir el crecimiento de cholangiocytes en monocapas, que luego pueden ser tripsinizaron y re plateado para uso experimental.
Introduction
El origen y desarrollo de cholangiocytes intra y extrahepáticas son marcadamente diferentes. El hígado se desarrolla a partir de un divertículo del intestino anterior endodermo ventral 5. La región caudal del divertículo forma el árbol biliar extrahepático, mientras que la región craneal genera el árbol biliar intrahepático 5. Cholangiocytes conductos intrahepáticos se derivan de células progenitoras alrededor de la placa ductal en las regiones portal peri 6. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse en hepatocitos o colangiocitos 6. Esto tiene importantes implicaciones clínicas dado que cholangiopathies pueden dirigirse específicamente a una categoría de cholangiocytes. Por ejemplo, atresia biliar afecta inicialmente los conductos extrahepáticos del recién nacido, mientras que el síndrome de Alagille afecta conductos intrahepáticos.
Hay múltiples descripciones de la aislamiento de cholangiocytes intrahepáticos y unidades de conducto biliar de ratones y ratas. Entigadores han aislado células individuales mediante el aislamiento de conductos y la posterior derivación o por digestión del hígado y el anticuerpo desplegable de cholangiocytes que expresan marcadores de superficie celular específicos 1-4. Unidades funcionales de las vías biliares y polarizados se han aislado por digestión del hígado y la filtración de tamaño 7. Unidades de conductos biliares son capaces de responder a los estímulos secretora y demostrar la secreción de líquido 7, mientras cholangiocytes aislados se ha demostrado que el desarrollo de las estructuras ductular in vitro 1,2. Las limitaciones de estos métodos incluyen la necesidad de conocimientos técnicos especializados y equipos especiales para la perfusión del hígado con las enzimas digestivas. Además, hay un riesgo de contaminación con células mesenquimales 3.
Un método para aislar extrahepáticos cholangiocytes del conducto biliar, específicamente de los conductos biliares extrahepáticos neonatales, no se ha descrito previamente. En este trabajo se describe una técnica simplificada para aislar un neonatals así como las células de las vías biliares extrahepáticas adultos en los altos niveles de pureza. Esta técnica facilitará el estudio de las diferencias entre cholangiocytes y la investigación sobre los mecanismos de enfermedades como la atresia biliar que implican los conductos intra y extrahepáticas extrahepáticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe es una técnica para aislar cholangiocytes puros a partir de las vías biliares extrahepáticas de los ratones de los ratones de todas las edades, incluidos los recién nacidos. La técnica ofrece la ventaja de que cholangiocytes extrahepáticos se pueden estudiar por separado de cholangiocytes intrahepáticas, y puede facilitar los estudios para identificar las diferencias clave entre estas poblaciones de células. Hemos publicado recientemente un estudio que demuestra disminuyó cilios en cholangiocy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Patología Molecular and Imaging Core del NIDDK Centro de la Universidad de Pensilvania de Estudios Moleculares de las Enfermedades Digestivas y Hepáticas (DK50306 P30) para la asistencia con la imagen. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (R01 DK-092111) y de la Fred y Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW) y por una beca de la Red de Investigación de Enfermedades del hígado infantil y Educación (SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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