Isolering av neonatal Extrahepatisk Cholangiocytes
Summary
En teknik för att isolera cholangiocytes från extrahepatiska gallgångarna av neonatala möss beskrivs. Kanalerna är noggrant dissekeras, och sedan cellerna isoleras genom utväxt i tjocka kollagengeler. Denna metod ger ett användbart verktyg för att studera extrahepatisk gallgången utveckling och patologi.
Abstract
Den intra-och extrahepatiska gallgångarna i levern är utvecklingsmässigt distinkta, och kan på olika sätt drabbas av vissa sjukdomar. Men skillnaderna mellan intra-och extrahepatiska cholangiocytes, samt mellan neonatala och vuxna celler, är inte väl förstådd.
Metoder för isolering av cholangiocytes från intrahepatiska gallgångar är väletablerade 1-4. Isolering av extrahepatiska duktal celler, särskilt från det nyfödda barnet, har ännu inte beskrivits, även om detta skulle vara till stor nytta för att förstå skillnaderna mellan olika cholangiocyte populationer och studera sjukdomar som gallgångsatresi som tycks rikta extrahepatiska kanaler. Beskrivs här är en optimerad teknik för att isolera både neonatala och vuxna mus extrahepatiska gallgångsceller. Denna teknik ger en ren cellpopulation med minimal kontamination från mesenkymala celler såsom fibroblaster.
Detta method bygger på att avlägsna de extrahepatiska ledningar och gallblåsan, följt av noggrann dissekering och skrapning för att avlägsna fett och fibroblast skikt. Konstruktioner är inbäddade i tjocka lager av kollagen och odlades under ca 3 veckor för att tillåta utväxt av cholangiocytes i monoskikt, vilka därefter kan trypsiniserade och åter pläterade för experimentell användning.
Introduction
Ursprung och utveckling av intra-och extrahepatiska cholangiocytes är markant annorlunda. Levern utvecklas från en divertikel av den ventrala tarmen endoderm 5. Den caudal regionen av divertikel bildar extrahepatisk biliär trädet, medan skallen genererar intrahepatisk galla träd 5. Intrahepatiska kanal cholangiocytes härrör från stamceller runt duktal plattan i de peri portal områdena 6. Dessa celler har förmågan att differentiera till antingen hepatocyter eller cholangiocytes 6. Detta har viktiga kliniska implikationer som ges att cholangiopathies specifikt kan rikta en kategori av cholangiocytes. Exempelvis gallgångsatresi påverkar initialt de extrahepatiska kanaler i det nyfödda barnet, medan Alagilles syndrom påverkar intrahepatiska kanaler.
Det finns flera beskrivningar av isolering av intrahepatiska cholangiocytes och gallgång enheter från mus och råtta. Ivestigators har isolerat enstaka celler genom kanalisolering och efterföljande utväxt, eller genom levern matsmältning och antikropp dra ner på cholangiocytes uttrycker specifika cellytemarkörer 1-4. Funktionella och polarise gallgången heter har isolerats från levern matsmältning och storleksfiltrering 7. Gallgången enheter är kapabla att svara på sekretoriska stimuli och demonstrera vätskeutsöndring 7, medan enstaka cholangiocytes har visat sig utveckla ductular strukturer in vitro 1,2. Begränsningar av dessa metoder är behovet av specialiserad teknisk kompetens och specialutrustning för leverperfusion med matsmältningsenzymer. Dessutom finns det en risk för kontaminering med mesenkymala celler 3.
En metod för att isolera extrahepatiska gallgången cholangiocytes, specifikt från neonatala extrahepatiska gallgångar, har inte tidigare beskrivits. Detta dokument beskriver en förenklad teknik för att isolera neonatal as liksom vuxna extrahepatiska gallgångsceller vid höga nivåer av renhet. Denna teknik kommer att underlätta studier av skillnader mellan intra-och extrahepatiska cholangiocytes och forskning om mekanismer för sjukdomar som gallgångsatresi som involverar de extrahepatiska kanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs här är en teknik för att isolera rena cholangiocytes från de extrahepatiska gallgångarna av möss av möss i alla åldrar, inklusive nyfödda. Tekniken erbjuder fördelen att extrahepatiska cholangiocytes kan studeras separat från intrahepatiska cholangiocytes, och kan underlätta studier för att identifiera viktiga skillnader mellan dessa populationer av celler. Vi har nyligen publicerat en studie som visar minskad flimmerhår i extrahepatiska cholangiocytes isolerats med denna metod och infekterade med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma för molekylär patologi och Imaging Core i UPenn NIDDK Center for Molecular Studies i Digestive och leversjukdomar (P30 DK50306) för hjälp med bildbehandling. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (R01 DK-092.111) och från Fred och Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (till RGW) och genom ett stipendium från Childhood Leversjukdom Forskning och utbildning Network (SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
