Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu
Summary
Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.
Abstract
Karaciğer içi ve ekstrahepatik safra kanalları gelişimsel farklıdır ve farklı şekilde bazı hastalıklar etkilenebilir. Ancak, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve yenidoğan ve yetişkin hücreleri arasındaki arasındaki farklar, iyi anlaşılmış değildir.
Intrahepatik safra kanallarının ikinci cholangiocytes izolasyonu için yöntemler de 1-4 kurulmuştur. Bu ayrı cholangiocyte popülasyonları arasındaki farklılıkları anlamak ve ekstrahepatik kanalları hedef gibi görünür, safra atrezi gibi hastalıklara okuyan büyük fayda olacağını, ancak özellikle Yenidoğandan ekstrahepatik duktal hücrelerin izolasyonu, henüz tarif edilmemiştir. Neonatal ve yetişkin fare hem de ekstra-hepatik safra kanalı hücreleri izole etmek için optimize edilmiş bir teknik aşağıda tarif edilmiştir. Bu teknik, fibroblastlar gibi mezenkimal hücrelerden en az kirlenme ile saf bir hücre popülasyonu elde edilir.
Bu metod titiz diseksiyon ve yağ ve fibroblast tabakaları kaldırmak için kazıma tarafından takip ekstrahepatik kanalları ve safra kesesi, çıkarılması dayanmaktadır. Yapılar deneysel kullanım için daha sonra tripsinize edilebilir ve kaplama yeniden tek katmanlarda cholangiocytes arasında gelişimini sağlamak için yaklaşık 3 hafta boyunca kollajen ve kültüre kalın tabakalar gömülür.
Introduction
Intra ve ekstrahepatik cholangiocytes kökeni ve gelişim belirgin farklıdır. Karaciğer ventral foregut endoderm 5 bir divertikül gelişir. Kranial bölge intrahepatik safra yolları 5 üretirken divertikül kaudal bölge, ekstrahepatik safra yolları oluşturur. Intrahepatik kanal cholangiocytes peri portal bölgelerde 6'da duktal plaka çevresinde projenitör hücrelerinden türetilmiştir. Bu hücreler hepatositler veya cholangiocytes 6 ya da içine ayırt etmek yeteneğine sahip. Bu cholangiopathies özellikle cholangiocytes bir kategori hedef olabileceğini verilen önemli klinik etkileri vardır. Alagille Sendromu intrahepatik kanalları etkiler Örneğin, biliyer atrezi başlangıçta, yenidoğanın ekstrahepatik kanalları etkiler.
Fare ve sıçan cholangiocytes intrahepatik safra kanalı ve birimlerin tecrit çok açıklamaları vardır. Içindevestigators kanal izolasyon ve sonraki akıbet tarafından tek hücreleri izole veya karaciğer sindirim ve antikor spesifik hücre yüzey belirteçleri 1-4 ifade cholangiocytes aşağı çekme var. Fonksiyonel ve polarize safra kanalı birimleri karaciğer sindirim ve boyut filtrasyon 7 tarafından izole edilmiştir. Safra kanalı tane izole cholangiocytes vitro 1,2 kanalsal yapıların geliştirilmesi için gösterilmiştir ve, uyarı salgılama ve sıvı salgı 7 göstermek için yanıt yeteneğine sahiptir. Bu yöntemlerden Sınırlamalar sindirim enzimleri ile karaciğer perfüzyon için uzman teknik uzmanlık ve özel ekipman ihtiyacı bulunmaktadır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler 3 ile kirlenme riski vardır.
Özel olarak neonatal ekstrahepatik safra kanallarının ikinci, ekstrahepatik safra kanalı cholangiocytes izole edilmesi için bir yöntem olup, daha önce tarif edilmemiştir. Bu yazıda yenidoğan a izole etmek için basitleştirilmiş bir teknik özetliyoriyi saflık yüksek seviyelerde yetişkin ekstrahepatik safra kanalı hücreleri olarak var. Bu teknik, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve ekstrahepatik kanalları dahil safra atrezi gibi hastalıkların mekanizmaları araştırma arasındaki farkların çalışma kolaylaştıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yenidoğan dahil her yaştan farelerin farelerin ekstrahepatik safra kanallarında saf cholangiocytes izole etmek için bir tekniktir. Teknik ekstrahepatik cholangiocytes intrahepatik cholangiocytes ayrı ele alınabilir ki avantaj sunuyor, ve hücrelerin bu toplumlar arasında önemli farklılıklar tespit çalışmaları kolaylaştırabilir. Biz son zamanlarda bir çalışma demonstrating bu yöntemle izole ve al yanaklı rotavirüs 8 ile enfekte ekstrahepatik cholangiocytes içinde kirpi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Sindirim Moleküler Araştırmalar UPenn NIDDK Merkezi Moleküler Patoloji ve Görüntüleme Çekirdek ve görüntüleme yardım için Karaciğer Hastalıkları (P30 DK50306) müteşekkiriz. Bu çalışma (RGW için) Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DK-092111) gelen ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi'nden hibe ile ve (SK) Çocukluk Karaciğer Hastalıkları Araştırma ve Eğitim Ağı bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
