신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

Summary

신생아 생쥐의 간외 담관에서 cholangiocytes을 분리하는 기술을 설명한다. 덕트 꼼꼼하게 해부 한 다음 세포는 두꺼운 콜라겐 젤의 부산물에 의해 격리됩니다. 이 방법은 간외 담관 개발 및 병리 공부를위한 유용한 도구를 제공합니다.

Abstract

간 인트라 및 간외 담관이 발달 별개이며, 차동 특정 질환에 의해 영향을받을 수있다. 그러나, 내부 및 간외 cholangiocytes, 신생아와 성인 세포 사이의 차이가 잘 이해되지 않습니다.

간내 담관에서 cholangiocytes의 분리를위한 방법은 잘 ^1-4 설정됩니다. 이 별개의 cholangiocyte 집단 간의 차이를 이해하고, 간외 덕트를 대상으로 이와 같은 담도 폐쇄증과 같은 질병을 공부에 큰 도움이 될 것이지만, 특히 신생아에서 간외 유관 세포의 분리, 아직 설명되지 않았습니다. 신생아 및 성인 마우스 양쪽 간외 담관 세포를 분리하기 위해 최적화 된 기술은 여기에서 설명한다. 이 기술은 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포에서 최소한의 오염과 순수한 세포 인구를 산출한다.

이 메 톡시D는 철저한 해부와 지방과 섬유 아세포 층을 제거하는 긁기 다음 간외 덕트 및 담낭의 제거를 기반으로합니다. 구조는 실험적인 사용을 위해 다음 트립신 될 수 있으며, 도금 재 단층에 cholangiocytes의 파생물을 할 수 있도록 약 3 주 동안 콜라겐 배양의 두꺼운 층에 포함됩니다.

Introduction

내부 및 간외 cholangiocytes의 기원과 발전은 현저하게 다르다. 간은 복부 foregut의 내배엽 ⁵ 게실에서 개발하고 있습니다. 뇌 영역은 간내 담도 나무 ^5를 생성하는 동안 게실의 꼬리 영역은 간외 담도 트리를 형성한다. 간내 덕트 cholangiocytes는 요정 포털 지역 ⁶ 유관 플레이트 주변의 전구 세포에서 파생됩니다. 이러한 세포는 간세포 또는 cholangiocytes ⁶ 하나로 분화 할 수있는 능력이있다. 이 cholangiopathies 특별히 cholangiocytes의 하나의 카테고리를 타겟팅 할 수 있습니다 주어진 중요한 임상 적 의미를 가지고 있습니다. Alagille 증후군은 간내 덕트에 영향을 미치는 예를 들어, 담도 폐쇄증은 처음, 신생아의 간외 덕트에 영향을 미칩니다.

마우스 및 래트에서의 간내 cholangiocytes 및 담관 유닛 절연 다중 디스크립션이있다. 에vestigators 덕트 분리 이후의 부산물에 의해 하나의 세포를 고립, 또는 간 소화 항체에 의해 특정 세포 표면 마커 ^1-4을 표현 cholangiocytes의 풀다운있다. 기능 및 편광 담관 단위 간 소화 크기 여과 ^(7)....

Protocol

달리 명시되지 않는 한 전체 절차는 실온에서 수행된다. 모든 동물의 작업은 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 프로토콜에서 인도적인 조건 하에서 수행되어야한다.

1. 장비의 제조 및 솔루션

1. 조직 문화 후드와 인큐베이터 (그림 1A)에 근접 마우스 수술 테이블을 설정합니다. 참고 : 필요한 장비는 해부 현미경, 광원, 12.5 cm 긴 직선 홍채 가위, 좋은 팁을 6 인치가 아닌 톱니 모양의 곡선 집게, 4 인치 곡선 팁 (그림 1B)와 톱니 모양의 집게를 포함한다.
2. 수술 테이블에 70 % 알코올의 유리 비커에 멸균 악기를 배치합니다.
3. 무균 격리 미디어 (표 1)로 3 멸균 60mm 배양 접시를 채우; 수술 테이블에 두 개의 후드 하나, 얼음에 모두 배치합니다.
4. 쥐의 꼬리 콜라겐을 놓고,멸균 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 멸균, 살균 1 N 수산화 나트륨과 조직 문화 후드에서 담도 상피 세포 (BEC) 미디어 (표 1). 참고 : 콜라겐 얼음에 있어야합니다.

....

Results

신생아 마우스 간외 우수한 순도 cholangiocytes, K19의 면역 형광 염색법에 의해 설명되는 것과 같이 (그림 2A와 2B)의 인구의 분리에이 프로토콜의 결과를 사용하는; 우리는 성인 쥐에서 세포를 분리 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 두꺼운 콜라겐 겔에 단일 층을 형성하기 위해 갓 고립 담관의 세포 3 주 정도 관찰했다. cholangiocytes는 절연 도관으로부터 세포 시트를 형성하는 두꺼운 콜라겐에 걸쳐 선형 적으로 성장한다. 문화가 삼주 전에 분할하지 않으면 구멍이 세포의 시트에 나타납니다 이후 단층이, 자란되기 전에 세포를 분리하고 얇은 콜라겐 젤에 다시 도금해야한다. 최적의 세포 성장과 섬유 아세포의 오염을 최소화하기 위해, 해부 및 청소 단계 (2.3, 2.4) 동안 신중하고 꼼꼼하게 섬세한 간외 덕트를 둘러싼 결합 조직을 제거하는 것이 중요합니다. 석면의 성장이있는 경우폭발, 메스 또는 부드러운 흡인 두꺼운 콜라겐의 영향을받는 지역의 제거 이전에 분할 세포에 섬.......

Discussion

여기에 설명하는 것은 신생아를 포함한 모든 연령대의 마우스 마우스의 간외 담관에서 순수한 cholangiocytes을 분리하는 기술이다. 기술 간외 cholangiocytes은 간내 cholangiocytes 별도로 연구 될 수 있다는 장점을 제공하고, 이러한 세포의 집단 사이의 주요 차이점을 확인하는 연구를 용이하게 할 수있다. 우리는 최근하다는 연구가이 방법에 의해 고립 된 붉은 털 로타 바이러스 ^8에 감염 간외 cholangiocytes에 속눈썹을 감소 발표했다. 단점 기법은 노동 집약적이며, 세심한 박리가 섬유 아세포 오염을 방지하기 위해 필요하다는 것을 포함한다; 또한, 부산물 및 문화에 적어도 3 주 대부분의 실험을위한 충분한 세포를 얻기 위해 필요합니다. 따라서,이 세포는 두 가지 차원의 문화와 관련된 변경 사항을 반영 할 수 있습니다. 그것은 아직 얻어진 세포 집단은 줄기 세포 또는 세포의 유의 한 숫자를 포함하는지 여부를 결정되지 않은peribiliary 땀샘 ^{9,10에서의.}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500 ml, BEC 매체에 사용
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 ml,
비필수 아미노산과 함께 BEC 매체 MEM에	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, BEC 매체에 사용
슐린-트랜스페린-셀레늄	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, BEC 매체에 사용
Na Pyruvate	Cellgro	25-000-CL	5 ml, BEC 매체에 사용
화학적으로 정의된 지질 농축액	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 ml, BEC 매체에 사용
Penicillin-Streptomycin	Cellgro	30-002-CI	5 ml, BEC 배지 및 500 μ에 사용; 절연에서
l Gentamicin	Gibco/Life technologies	15750-060	0.2 ml, BEC 매체 및 500 μ에 사용됩니다. 엘 BEC
MEM 비타민 용액	Gibco / Life technologies	11120-052	5 ml
에탄올 아민	시그마 Aldrich	E9508-100ml	0.13 ml
콩 트립신 억제제	Biowhittaker	17-605E	5 ml에 사용되며 BEC 매체에 사용됩니다. 용매는 PBS, 5 mg/ml 재고 농도
L-글루타민	Cellgro	25-005-CL	5 ml, BEC 매체에 사용되는
소 뇌하수체 추출물	Gemini	500-102	1.1 ml, BEC 매체
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	0.5 ml, BEC 매체에 사용, Stock conc 393 μ 에탄올로 희석한 g/ml
3 3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma Aldrich	T6397	0.5 ml, BEC 매체에 사용, 에탄올로 희석한 재고 conc 3.4 mg/ml
표피 성장 인자	Millipore	01-101	0.5 ml, BEC 매체에 사용, 25 μ DMEM F12+1%BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	5 ml로 묽게 하는 g/ml는, BEC 매체에서 이용되고, 0.411 mg/ml의 재고 농도에 사용하고 DMSO
Fungizone	Gibco/Life technologies	15290-018	1 ml로 희석하고, BEC 매체와 500 μ에서 이용됩니다; l 격리에서
쥐꼬리 콜라겐	BD Biosciences	354236	콜라겐
PBS 10x	USB Corporation	75889	10x에서 사용, sterlie, 콜라겐을 만드는 데 사용되는 콜라겐 농도에 따라 사용 된 양은 콜라겐 농도에 따라 다릅니다
dH2< / sub>O	N	/ A	멸균, 콜라겐을 만드는 데 사용되며 사용되는 양은 콜라겐 농도 NaOH에 따라 다릅니다
10 N	Fischer Scientific	ss255-1	1 N으로 희석, 멸균, 콜라겐 제조에 사용, 사용되는 양은 콜라겐 농도에 따라 다릅니다
Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	형을 DMEM 및 멸균 필터에 희석하여 사용 전
트립신-EDTA (1x) 0.25%	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 ml, 최대 10분
배양 트립신-EDTA (10x) 0.5%	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, 최대 10
배양 현미경	Nikon	SMZ645	기타 모델 허용
광원(광섬유 조명기)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	기타 모델 허용
12.5cm 직선 홍채 가위	Kent Scientific		기타 모델 허용
6" 톱니 없는 곡선 집게 미세한 팁으로	전자 현미경 과학		기타 모델 허용
미세 팁이있는 4 인치 톱니 모양의 스테인리스 집게	전자 현미경 과학		기타 모델 허용