Ekstracellulære vesikler spiller vigtige roller i fysiologiske og patologiske processer, herunder koagulering, immunrespons og kræft eller som potentielle terapeutiske midler i drug delivery eller regenerativ medicin. Denne protokol indeholder metoder til kvantificering og størrelse karakterisering af isolerede og ikke-isolerede ekstracellulære vesikler i forskellige væsker ved hjælp af justerbar resistiv puls sensing.
Ekstracellulære vesikler (EVS), herunder 'mikrovesikler «og» exosomer «, er meget rigelige i kropsvæsker. De seneste år har der været en enorm stigning i interesse i elbiler. EVT har vist sig at spille vigtige roller i forskellige fysiologiske og patologiske processer, herunder koagulering, immunresponser, og kræft. Desuden elbiler har potentiale som terapeutiske midler, for eksempel som drug delivery køretøjer eller regenerativ medicin. På grund af deres lille størrelse (50 til 1.000 nm) nøjagtig kvantificering og størrelse profilering af elbiler er teknisk udfordrende.
Denne protokol beskriver, hvordan afstemmelige resistiv puls sensing (TRP) teknologi, ved hjælp af qNano system, kan anvendes til at bestemme koncentrationen og størrelsen af elbiler. Metoden, der bygger på påvisning af elbiler Ved overførslen gennem en nano mellemstore pore, er relativt hurtigt, tilstrækkeligt brugen af små prøvevolumener og kræver ikke, at PURverifikationsprogrammet og koncentration af elbiler. Næste til den almindelige drift protokollen en alternativ metode beskrives med prøver tilsat polystyrenkugler med kendt størrelse og koncentration. Denne realtid kalibrering teknik kan anvendes til at overvinde tekniske forhindringer stødt ved måling elbiler direkte i biologiske væsker.
Vesikler fra cellulær oprindelse er meget rigelige i kropsvæsker 1. Disse såkaldte ekstracellulære vesikler (EVS) (50 – 1.000 nm i størrelse) er dannet af enten fusion af multi-vesikulære organer med cellemembranen eller ved direkte udad knopskydning for cellemembranen. I de senere år har videnskabelig interesse i elbiler steget kraftigt, hvilket resulterer i et væld af EV-fokuserede publikationer, hvor nye funktioner og egenskaber af elbiler er beskrevet 1. Elbiler er nu menes at være involveret i en bred vifte af fysiologiske og patologiske processer, såsom signaltransduktion, immun regulering, og blod koagulation 1-4. I kræft, synes elbiler til at spille en rolle i dannelsen af premetastatic nicher 5,6, overførsel af pro-kræft indhold 7,8 og stimulering af angiogenese 8. Ud over dette, er elbiler udforsket som levering agenter for terapeutiske midler 9.
Trods disse deviklingen, pålidelig kvantificering af elbiler er fortsat udfordrende. Traditionelt anvendes indirekte kvantificering, der er afhængige af kvantificering af det samlede proteinindhold eller specifikke proteiner. Selvom bredt anvendt, har disse teknikker ikke højde for protein-per-EV forskelle, og ikke diskriminerer mellem forurenende protein aggregater og proteiner i elbiler. Desuden disse teknikker kræver isolering af elbiler, som i mange tilfælde gør sammenligning af EV-koncentrationer i biologiske prøver umuligt.
Derfor arbejdes der på at udvikle nye metoder, der giver mulighed for mere præcis og direkte EV måling 10. Denne rapport beskriver brugen af tunable resistiv puls sensing (TRP) til pålidelig kvantificering og størrelse profilering af elbiler.
Øjeblikket qNano instrument (figur 1a) er den eneste kommercielt tilgængelige platform for TRP. I TRP, en ikke-ledende elastisk membran præget with en nanostørrelse pore adskiller to fluidumceller. En af de flydende celler fyldt med prøven af interesse, mens den anden celle er fyldt med partikel-fri elektrolyt. Ved at anvende en spænding, der er etableret en ionisk strøm / elektrisk strøm, der er ændret ved overførsel af partikler gennem pore (1b figur). Størrelsen af denne aktuelle blokade ("resistiv puls") er proportional med mængden af partiklen 11 (figur 1c). Blokaden Varigheden kan bruges til at vurdere Zeta-potentialet af partikler, der bygger på partikel egenskaber såsom ladning eller forme 12. Størrelse profilering af ukendte partikler kan udføres ved at sammenligne de resistive impulser forårsaget af ukendte partikler med resistive impulser forårsaget af kalibrering partikler med en kendt diameter. Ud over omfanget af en blokade omstændigheder er hastigheden af hvor disse forekommer målt. Denne tæller sats relies på partikelkoncentrationen. Da koncentration og blokader er lineært proportional 13 med et enkelt kalibreringsprøve med partikler med kendt koncentration og partikelstørrelse giver mulighed for måling af koncentration 14 og størrelsesfordelingen 11 af en ukendt prøve.
Bevægelsen af partikler gennem nanopore bestemmes af elektro kinetic- (elektroforese og elektro-osmotisk) og fluidic kræfter 15. Ved hjælp af den variable tryk modulet (VPM) en trykforskel mellem de flydende celler kan induceres som en yderligere kraft. Påtrykning af positivt tryk forøger strømningshastigheden af partikler, som kan være af fordel, når partikelkoncentrationen er lav. Desuden kan tryk påføres for at reducere effekten af elektro-kinetiske kræfter. Dette er især vigtigt, når du bruger nanopores med en relativ lille porediameter (NP100, NP150 og muligvis NP200), som ofte bruges til påvisning af elbiler.For disse nanopores, selv når de anvender betydeligt pres, de elektro-kinetiske kræfter kan, afhængigt af partikel overflade afgift, forbliver nonnegligible 16. Ved at måle partikel hastigheden på mange belastninger, en elektromagnetisk kinetisk rettet, og dermed mere præcis, kan EV koncentrationen beregnes.
Her er detaljerede protokoller forudsat at bestemme størrelsesfordelingen og koncentrationen af elbiler. Ved siden af den almindelige drift-protokollen, er en alternativ metode, der er beskrevet, hvor prøverne tilsat polystyrenkugler med kendt størrelse og koncentration 17. Denne realtid kalibrering teknik kan anvendes til at overvinde nogle af de tekniske udfordringer opstår, når måling elbiler direkte i biologiske væsker, såsom urin, plasma og cellekultursupernatant eller når stabiliteten af nanopore over en lang måleperiode tid ikke kan være sikret.
De er beskrevet i dette manuskript tilbyde metoder til kvantificering og størrelse karakterisering af elbiler ved hjælp af TRP protokoller. De store fordele ved TRP-platformen er den lille sample størrelse, relativ kort måling varighed og fraværet af krævede prøve manipulation.
Forudsætning for nøjagtig TRP måling er at holde identiske betingelser mellem kalibrering og prøve målinger. Dette omfatter brugen af ens buffere samt identiske indstillinger instrument, såsom nanopore størrelse, spænding og anvendt tryk. Den oprindelige VPM mangler en mekanisme til nøjagtig indstilling af det anvendte tryk, hvorved mindre forskelle i anvendt tryk mellem prøverne. Desuden kan fordampning af priming fluid i VPM fremkalde mindre trykforskelle ved måling på forskellige tidspunkter og VPM derfor ofte re primet. Disse begrænsninger har potentielt blevet løst ved indføring af VPM2, somhar et klik-baserede skalering og lufttryk baseret på.
Den alternative protokol er beskrevet i dette skrift er særlig velegnet til måling af elbiler i ikke oprensede biologiske prøver 17. Vi mener, at buffer komponenter, såsom sukkerarter, lipider, proteiner og andre større klippestykker, kan i nogle tilfælde påvirke måleforholdene for meget for den standard-protokol til at være anvendelig. Tilsætning af kalibreringsperler til prøven i stedet for at sammenligne to særskilte målinger introducerer "real tid kalibrering«. Denne metode er især velegnet, når man sammenligner prøver (fx blodplasma forskellige donorer), der har forskellige og / eller ukendte strømningstekniske baggrund indhold. Selv om der er forskelle mellem elbiler og polystyren partikler (f.eks partikel tæthed og overflade gebyr), teoretiske modeller samt eksperimentelle data understreger anvendeligheden af polystyrenkugler til kvantificering og størrelse profilering af elbiler,under forudsætning, at betydeligt pres påføres 15,19. For at minimere indflydelsen af elektrokinetiske kræfter, er brugen af den relativt større NP150 / NP200 nanopore og signifikant positiv pres tilrådes.
Elbiler og kalibreringsperler er kendetegnet ved størrelse. Følgelig nanopore skal åbnes ved strækning, til en diameter, hvor påvisning af såvel elbiler og større kalibreringspartikler overholdes. Siden åbningen af pore vil reducere følsomhed over for mindre partikler, elbiler kun større end en vis størrelse registreres (ofte elbiler> 120 nm ved brug af en 335 nm kalibrering perle). Den mindste detektionsgrænse for elbiler kan reduceres til cirka 90 nm, ved hjælp af 203 nm kalibreringsperler på en NP150 nanopore. Dog kan denne opsætning ikke være rentable når større elbiler fremkalde hyppige tilstopning af nanopore. Tilstedeværelsen af disse blokerer elbiler kan tvinge udnyttelsen af en opsætning, hvor en population af elbiler, for lille til at reach detektionsgrænsen, ikke vil blive opdaget.
Vanskeligheden at drive systemet stiger, når de forsøger at måle partikler mindre end 100 nm i størrelse. I sådanne tilfælde kan påvisning forbedres ved at øge saltkoncentrationen af elektrolytten. En øget ion fusion vil fremkalde relativt øget blokade størrelser til små partikler (større signal-støj-forhold). Levedygtigheden af denne teknik til måling af elbiler skal valideres dog, som forhøjede saltkoncentrationer kan påvirke mængden af elbiler.
Som konklusion kan det TRP-platformen bruges til direkte kvantificering og størrelse karakterisering af elbiler. Da ingen isolering eller VE manipulation (antistof bindende eller fluorescerende mærkning) er påkrævet, platformen er egnet til direkte VE kvantificering i biologiske væsker. En alternativ protokol er fastsat, at kan være gavnligt for prøver, hvor pufferkomponenter inducere signifikant pore clogging arrangementer, hvilket gør pålidelig udnyttelse af standard protokol urentabel.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |