Cellulära blåsor spelar viktiga roller i fysiologiska och patologiska processer, inklusive koagulation, immunsvar och cancer eller som potentiella terapeutiska medel vid läkemedelstillförsel eller regenerativ medicin. Detta protokoll presenteras metoder för kvantifiering och storleks karakterisering av isolerade och icke isolerade extracellulära blåsor i olika vätskor med hjälp av avstämbara resistiv puls avkänning.
Cellulära vesikler (EVS), inklusive "mikrovesiklar" och "exosomes", förekommer rikligt i kroppsvätskor. De senaste åren har det skett en enorm ökning av intresset för elbilar. Elbilar har visat sig spela en viktig roll i olika fysiologiska och patologiska processer, inklusive koagulation, immunsvar, och cancer. Dessutom EVs har potential som terapeutiska medel, exempelvis som läkemedelsleveransfordon eller som regenerativ medicin. På grund av sin ringa storlek (50 till 1000 nm) exakt kvantifiering och storlek profilering av elbilar är tekniskt utmanande.
Detta protokoll beskriver hur avstämbara resistiv pulsanalys (TRP)-teknik, med användning av qNano systemet, kan användas för att bestämma koncentrationen och storleken av elfordon. Metoden, som bygger på detektion av elfordon vid överföringen genom en nanostora porer, är relativt snabb, räcker användning av små provvolymer och kräver inte purläggande och koncentration av elfordon. Bredvid den ordinarie verksamheten protokollet ett alternativt tillvägagångssätt beskrivs med prov spetsat med polystyrenkulor med känd storlek och koncentration. Denna realtidskalibreringsteknik kan användas för att övervinna tekniska hinder påträffas vid mätning elbilar direkt i biologiska vätskor.
Blåsor från cellulära ursprung är mycket rikligt i kroppsvätskor 1. Dessa så kallade extracellulära vesikler (EVS) (50 – 1000 nm i storlek) bildas antingen genom fusion av flera vesikulära organ med cellmembranet eller genom direkt utåt knoppning av cellmembranet. Under senare år har vetenskapligt intresse för elbilar ökat kraftigt, vilket resulterade i en uppsjö av EV-inriktade publikationer, där nya funktioner och egenskaper hos elbilar beskrivs 1. Elbilar är nu tros vara inblandad i ett brett spektrum av fysiologiska och patologiska processer såsom signaltransduktion, immunreglering och blodkoagulering 1-4. I cancer, elbilar tycks spela en roll i bildandet av premetastatic nischer 5,6, överföring av pro-cancer innehåll 7,8 och stimulering av angiogenes 8. Förutom detta är elbilar undersökas som leverans agenter för terapeutiska medel 9.
Trots dessa delingen, tillförlitlig kvantifiering av elbilar är fortfarande utmanande. Traditionellt indirekta kvantifieringsmetoderna används som förlitar sig på kvantifiering av totala proteininnehållet eller specifika proteiner. Även om i stort sett används inte dessa tekniker inte hänsyn till protein-per-EV skillnader, och inte diskriminerar mellan förorenande proteinaggregat och proteiner i elbilar. Dessutom är dessa tekniker kräver isolering av elbilar, vilket i många fall gör jämförelse av EV-koncentrationer i biologiska prover omöjligt.
Därför görs även ansträngningar för att utveckla nya metoder som möjliggör mer exakt och direkt EV mätning 10. Denna rapport beskriver användningen av avstämbara resistiv puls avkänning (TRP) för tillförlitlig kvantifiering och storlek profilering av elbilar.
För närvarande qNano instrumentet (Figur 1a) är den enda kommersiellt tillgängliga plattform för TRP. I TRPS, ett icke-ledande elastiska membranet inrutat with en nanostora porer är att separera två vätske celler. En av de fluid celler fylls med provet av intresse, medan den andra cellen är fylld med partikelfria elektrolyten. Genom att applicera en spänning, är en jonisk flöde / elektrisk ström etablerad, vilken ändras vid överföringen av partiklar genom poren (figur 1b). Storleken av denna ström blockad (resistiv puls ") är proportionell mot partikelns volym 11 (figur 1c). Blockaden längd kan användas för att bedöma Zeta-potentialen av partiklar, som förlitar sig på partikelegenskaper såsom laddning eller form 12. Storlek profilering av okända partiklar kan utföras genom att jämföra de resistiva pulser orsakade av de okända partiklar med de resistiva pulser orsakade av kalibreringspartiklar med en känd diameter. Förutom storleken på en blockad händelse, är den hastighet som dessa inträffar mäts. This räknehastigheten relies på partikelkoncentrationen. Eftersom koncentrationen och hastigheten för blockad är linjärt proportionell 13, med användning av en enda kalibreringsprov med partiklar med känd koncentration och partikelstorlek möjliggör mätning av koncentration 14 och storleksfördelning 11 av ett okänt prov.
Förflyttning av partiklar genom nanopore bestäms av elektro kinetic- (elektrofores och elektro-osmotiska) och fluidkrafter 15. Genom att använda modulen variabelt tryck (VPM) en tryckskillnad mellan de fluid celler kan induceras som en ytterligare kraft. Applicera positivt tryck ökar flödet av partiklar, som kan vara av nytta när partikelkoncentrationen är låg. Dessutom kan trycket tillämpas för att minska effekten av elektro kinetiska krafter. Detta är särskilt viktigt när man använder nanoporer med en relativt liten pordiameter (NP100, NP150 och NP200 eventuellt) som ofta används för detektion av elbilar.För dessa nanoporer, även vid tillämpningen betydande tryck, de elektro kinetiska krafter kan, beroende på partikelytan laddning, förblir nonnegligible 16. Genom att mäta partikelhastighet vid flera tryck, en elektro kinetiskt korrigeras, och därmed mer exakt, kan EV koncentrationen beräknas.
Här är detaljerade protokoll tillhandahålls för att bestämma storleksfördelning och koncentration av elbilar. Bredvid den ordinarie verksamheten protokollet, är ett alternativt tillvägagångssätt beskrivs där prover spetsas med polystyrenkulor med känd storlek och koncentration 17. Denna realtidskalibreringsteknik kan användas för att övervinna några av de tekniska utmaningar stött vid mätning EVs direkt i biologiska vätskor, såsom urin, plasma och cellkultursupernatant eller när stabiliteten i nanopore under en lång period av mättid inte kan vara säkerställas.
Protokollen i detta manuskript erbjuder metoder för kvantifiering och storlek karakterisering av elbilar använder TRPS. De stora fördelarna med TRP-plattformen är det lilla urvalet, relativt korta mätningstiden och avsaknaden av behov prov manipulation.
Förutsättning för exakt TRPS mätning är att hålla förhållanden identiska mellan kalibrering och provmätningar. Detta omfattar användningen av identiska buffertar samt identiska instrumentinställningar, till exempel nanopore storlek, spänning och pålagt tryck. Den ursprungliga VPM saknar en mekanism för exakt inställning av det applicerade trycket och därmed orsakar mindre skillnader i applicerat tryck mellan proverna. Dessutom kan avdunstning av priming vätska i VPM framkalla små tryckskillnader vid mätning vid olika tidpunkter och VPM bör därför ofta åter primas. Dessa begränsningar har potentiellt lösts genom införandet av VPM2, vilkethar en klickbaserad skalning och lufttryck bygger.
Den alternativa protokoll som beskrivs i detta manuskript är speciellt lämpad för mätning av elfordon i icke renade biologiska prover 17. Vi tror att buffertkomponenter, såsom socker, lipider, proteiner och andra större skräp, kan i vissa fall påverka mätningsförhållandena för mycket för standardprotokollet för att kunna tillämpas. Tillsats av kalibreringspärlor till provet i stället för att jämföra två separata mätningar introducerar "realtidskalibrering". Denna metod är särskilt lämplig när man jämför prover (t.ex. blodplasma olika givare) som har olika och / eller okända fluidbakgrunds innehåll. Även om skillnader finns mellan elbilar och polystyrenpartiklar (t.ex. partikeltäthet och yta avgift), teoretiska modeller samt experimentella data stryker användbarheten av polystyrenkulor för kvantifiering och storlek profilering av elbilar,under förutsättning att betydande tryck appliceras 15,19. För att minimera påverkan av elektrokinetiska krafter, är användning av den relativt större NP150 / NP200 nanopore och betydande övertryck rekommenderas.
Elbilar och kalibreringspärlor utmärks av storlek. Följaktligen måste nanopore som öppnas genom att sträcka, till en diameter där detektering av både elbilar och de större kalibreringspartiklar observeras. Sedan öppnandet av por minskar känsligheten för mindre partiklar, EVS bara större än en viss storlek registreras (ofta EV> 120 nm vid användning av en 335 nm kalibrering pärla). Den lägsta detektionsgränsen för elbilar kan minskas till cirka 90 nm, med hjälp av 203 nm kalibrerings pärlor på en NP150 nanopore. Dock kan denna inställning vara olönsamma när större elbilar inducerar ofta igensättning av nanopore. Förekomsten av dessa hindrar elbilar kan tvinga användningen av en installation där en population av elbilar, för liten för att reach tröskeldetektering, inte kommer att detekteras.
Svårigheten att driva systemet ökar när man försöker mäta partiklar mindre än 100 nm i storlek. I sådana fall kan detekteringen förbättras genom att öka saltkoncentrationen i elektrolyten. En ökad jonkoncentration inducerar relativt ökade blockad magnituder för små partiklar (större signal-till-brus-förhållande). Lönsamheten för denna teknik för mätning av elbilar måste valideras dock som ökade saltkoncentrationer kan påverka volymen av elfordon.
Sammanfattningsvis kan det TRPS plattform användas för direkt kvantifiering och storlek karakterisering av elbilar. Eftersom ingen isolering eller EV manipulation (antikroppsbindande eller fluorescerande märkning) krävs, är plattformen lämpar sig för direkt EV kvantifiering i biologiska vätskor. Ett alternativt protokoll tillhandahålls som kan vara till nytta för prover där buffertkomponenter inducerar betydande por clogging händelser, vilket gör tillförlitlig användning av standardprotokollet olönsamt.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |