Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em> In vivo</em
Summary
Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die> 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.
Abstract
Het vermogen om T-cel responsen in vivo monitoren is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons en het ontwerp van immuuntherapie. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel array (FTA) technologie, die vitale kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE), violette laser prikkelbaar kleurstoffen (CellTrace Violet: CTV) maakt gebruik van en rode laser prikkelbaar kleurstoffen (Celproliferatie Dye eFluor 670: CPD ) naar label muis lymfocyten combinatorieel in> 250 waarneembaar fluorescerende cel clusters. Cell clusters binnen deze overeenkomsten kunnen worden gepulst met major histocompatibility (MHC) klasse-I en MHC klasse-II-bindende peptiden en daardoor fungeren als doelcellen respectievelijk CD8 + en CD4 + T-cellen. Deze FTA cellen levensvatbaar blijven en volledig functioneel, en derhalve worden toegediend in muizen beoordeling van CD8 + T-cel gemedieerde doding van doelwitcellen FTA en CD4 + T-cellen nagedacht hel toestaanp FTA B cel doelcellen in real time in vivo door flowcytometrie. Sinds> 250 doelcellen kan worden beoordeeld in een keer, de techniek maakt het monitoren van T-cel responsen tegen meerdere antigeen epitopen bij verschillende concentraties en in meerdere herhalingen. Als zodanig kan de techniek T-cel responsen te meten zowel kwantitatief (bijvoorbeeld de cumulatieve grootte van de respons) en een kwalitatieve (bijv.. Functionele aviditeit en epitoop-kruisreactiviteit van de respons) niveau. Hierin beschrijven we hoe deze FTA geconstrueerd en geven een voorbeeld van hoe ze kunnen worden toegepast om T-cel responsen geïnduceerd door een recombinant pokkenvirus vaccin te beoordelen.
Introduction
T-cellen spelen een centrale rol bij de adaptieve immuunrespons en zijn vaak gericht op manipulatie immunotherapie. CD4 + effector-T-cellen reageren op vreemd antigeen door het afscheiden van cytokines dat veel aspecten van de immuniteit regelen en kan ook direct helpen B-cellen om antistoffen te produceren. CD8 + cytotoxische T-cellen (CTL) kunnen ook reageren op vreemd antigeen door het afscheiden van cytokines, evenals een centrale rol spelen in het direct doden van cellen die een vreemd antigeen. De fundamentele interactie die deze T cel effectorfuncties initieert houdt de interactie van de T cel receptor (TCR) met vreemde peptiden die op MHC moleculen op het oppervlak van cellen. CD4 + T-cellen herkennen peptiden die op MHC klasse II moleculen op antigeen presenterende cellen en CD8 + T-cellen herkennen peptiden die op MHC klasse-I-moleculen die doorgaans worden weergegeven microben geïnfecteerde cellen.
In ordede rol van T-cellen spelen een immuunrespons te beoordelen, is het essentieel dat de effectorfuncties worden gemeten door betrouwbare en gevoelige technieken. Gemeenschappelijke methoden voor de beoordeling van T-cel respons op te nemen; MHC class-I/II/peptide tetramer reactiviteit; cytokine productie door ELISPOT en intracellulaire cytokine kleuring; en doden capaciteit met 51Cr afgifte assays. Deze testen zijn echter meestal ex vivo uitgevoerd met in vitro stimulatie, of om beperkt inzicht in T-celfunctie. Idealiter bij het meten van T celresponsen het nuttig om te beoordelen in situ in vivo zou zijn als ze zich voordoen, zonder manipulatie van T-cellen om veranderingen in de functionele parameters die kunnen optreden door in vitro stimulatie voorkomen. Enkele van de meest gebruikte in vivo T-cel functionele assays zijn gebaseerd op het meten van CTL gemedieerd doden van doelcellen gepulseerd met MHC klasse I-bindende peptiden, die in vivo worden opgesomdvia hun opsporing door fluorescentielabelling met vitale kleurstoffen zoals CFSE. Hoewel deze soorten tests kunnen controleren CTL gemedieerde doden van doelen als ze gebeuren in vivo, hebben ze eerder een relatief beperkte capaciteit doden van meerdere doelen presenteren verschillende concentraties en verschillende peptide-epitopen, die nodig is om kwalitatieve parameters toelaten na als functionele avidity en epitoop variant kruisreactiviteit worden beoordeeld. Deze testen tonen geen enkele informatie op CD4 + T-cel gemedieerde responsen.
Om veel van de beperkingen met de huidige methoden voor T cel responsen bepalen overwinnen, hebben wij onlangs een multiplex assay gebaseerd op fluorescente doel arrays (FTA), die de controle van T-cel responsen tegen> 250 doelcellen gelijktijdig kan in een dierlijke flowcytometrie 1, 2. Vrijhandelsovereenkomsten bestaan uit lymfocyten gelabeld met SEVmene concentraties en combinaties van vitale kleurstoffen zoals CFSE, CTV en CPD toestaan> 250 celgroepen unieke fluorescentie te genereren. Aangezien deze cellen levensvatbaar en volledig functioneel blijven, kunnen ze worden geïnjecteerd in dieren controle van hun interactie met effector T-cellen in vivo 3 mogelijk. Bijvoorbeeld kan de FTA celclusters worden gepulseerd met MHC-klasse I-bindende peptiden voor de beoordeling van antigeen-specifieke CTL gemedieerde doding van doelwitcellen 1 mogelijk. Bovendien kan de FTA celclusters worden gepulst met MHC klasse II-bindende peptiden, waardoor beoordeling van antigeen specifieke T-helper cel activiteit (TH) door beoordeling activatie (door aanslag van activatie merkers zoals CD69, CD44 en / of CD62L) van B-cellen binnen de FTA lager verwante peptide 2. Al meer dan 250 doelen tegelijkertijd kan worden gedetecteerd, is het mogelijk om CTL en TH-responsen tegen vele doelwitcel clusters gepulseerd met n metenumerous peptiden in verschillende concentraties en de opname van vele herhalingen. De FTA test geeft dan ook een ongekend niveau van T-cel effector respons evaluatie in vivo.
Hier beschrijven we in detail de constructie van een FTA zien hoe ze kunnen worden toegepast op de beoordeling van T-cel responsen in vivo. De procedure beschrijft de constructie van een FTA bestaat uit 252 waarneembare celgroepen door middel van drie essentiële kleurstoffen, bestaande uit 6 herhalingen van 42 celgroepen gepulst met MHC klasse-I en II-bindende peptiden. De etikettering van 42 celgroepen optreedt in 10 ml conische buisjes bodem en het is nuttig te leggen die in een buis rek zoals aangegeven in tabel 1. Deze methode kan worden aangepast voor kleinere aantallen onderscheiden clusters zoals vereist door de hoeveelheid etikettering van elke kleurstof uitgevoerd 1.
We benadrukken het nut van de test door te laten zien hoe deze respons kan metenes gegenereerd door recombinant pokken-virus vaccinatie tegen meerdere epitopen in een klein cohort van muizen. Hieruit blijkt dat het FTA test kan worden gebruikt om cumulatief reacties en functionele aviditeit meten door respectievelijk het gebruik van de oppervlakte onder de curve (AUC) evaluatie en meting van effectieve peptide concentratie vereist om half-maximale respons (EC 50) te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voordeel van FTA-gebaseerde testen is dat ze de discriminatie van> 250 levensvatbare en volledig functionele doelcel populaties van een gastheerdier door flowcytometrie. Dit verschaft een niveau van complexiteit in vivo flowcytometrie gebaseerde testen die voorheen niet mogelijk was. Dit wordt benadrukt in de 2 dierproeven hierboven, waarbij reacties op 7 verschillende virale epitopen bij 6 concentraties kunnen worden gecontroleerd replicaten van 6 gelijktijdig in een dier waarbij parameters zoals AUC en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door projectsubsidies # 1010395 (BQ en CP) en # 525431 (CR) en een Program Grant # 455395 (CP) van de National Health and Medical Research Council of Australia, een Australische Centrum voor Hepatitis en HIV Virologie EOI 2012 subsidie (CR en RJJ) en een subsidie van de Gordon and Gretel Bootes Foundation (BQ en CR). Wij willen Harpreet Vohra en Michael Devoy bedanken voor hun uitstekende onderhoud van de JCSMR FACS laboratorium, de Australische Cancer Research Foundation Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, voor peptide synthese, en Dr David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australië voor het verstrekken van de ouder HIV-vaccin voorraden.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
