L'uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em> In vivo</em
Summary
La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta> 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.
Abstract
La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria e la progettazione di immunoterapie. Qui si descrive l'uso della tecnologia matrice di destinazione fluorescente (FTA), che utilizza coloranti vitali come ester carbossifluoresceina succinimidyl (CFSE), laser viola coloranti eccitabili (CellTrace Violet: CTV) e laser rosso coloranti eccitabili (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) per combinatorialmente linfociti del mouse etichette in> 250 distinguibili gruppi di cellule fluorescenti. Gruppi di cellule all'interno di questi ALS possono essere pulsate con maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e MHC classe II-peptidi leganti e quindi agiscono come cellule bersaglio per CD8 + e CD4 +, rispettivamente. Queste cellule FTA rimangono vitali e pienamente funzionale, e possono quindi essere somministrati in topi per consentire la valutazione della CD8 + T uccisione cellulo-mediata delle cellule bersaglio FTA e CD4 + T hel cell-meditatap delle cellule bersaglio cellule FTA B in tempo reale in vivo mediante citometria a flusso. Da> 250 cellule bersaglio possono essere valutati in una volta, la tecnica consente di monitorare risposte delle cellule T contro diversi epitopi antigenici in diverse concentrazioni e in più replicati. Come tale, la tecnica può misurare le risposte delle cellule T sia un quantitativo (ad esempio la grandezza cumulativo della risposta) e qualitativa (ad es. Avidità funzionale e epitopo-cross reattività della risposta) livello. Qui, descriviamo come tali ALS sono costruiti e danno un esempio di come possono essere applicati per valutare le risposte delle cellule T indotta da un vaccino pox virus ricombinante.
Introduction
Cellule T svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria adattativa e sono spesso mirati per la manipolazione in immunoterapia. Cellule T effettrici CD4 + rispondono ai antigene estraneo secernendo citochine che regolano molti aspetti di immunità e può anche aiutare direttamente le cellule B a produrre anticorpi. Cellule CD8 + T citotossici (CTL) possono anche rispondere alle antigene estraneo secernendo citochine, così come un ruolo centrale nella uccidere direttamente le cellule che esprimono un antigene estraneo. L'interazione fondamentale che avvia queste funzioni effettrici delle cellule T comporta l'interazione del recettore delle cellule T (TCR) con peptidi estere visualizzati su molecole MHC sulla superficie delle cellule. Cellule CD4 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe II sulle cellule presentanti l'antigene e cellule CD8 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe I che sono tipicamente visualizzati su cellule microbiche infetti.
Al finevalutare il ruolo delle cellule T svolgono in una risposta immunitaria, è essenziale che le loro funzioni effettrici sono misurati con tecniche affidabili e sensibili. Metodi comuni per la valutazione della risposta delle cellule T includono; MHC class-I/II/peptide tetramero reattività; produzione di citochine da ELISPOT e intracellulare di citochine colorazione; e la capacità di uccidere con 51 saggi Cr-rilascio. Questi saggi, però, vengono in genere eseguite ex vivo con la stimolazione in vitro, o forniscono informazioni limitate nella funzione delle cellule T. Idealmente, quando si misurano le risposte delle cellule T sarebbe utile per valutare in situ, in vivo in cui si verificano, senza manipolazione di cellule T in modo da evitare alterazioni dei parametri funzionali che possono verificarsi attraverso la stimolazione in vitro. Alcuni dei più comunemente usato in vivo di cellule T saggi funzionali sono basati sulla misurazione uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio pulsate con MHC di classe I peptidi leganti, che vengono enumerati in vivotramite la loro individuazione attraverso l'etichettatura fluorescente con coloranti vitali come CFSE. Anche se questi tipi di test in grado di monitorare l'uccisione CTL mediata di obiettivi quando accadono in vivo, che hanno già avuto una capacità relativamente limitata di valutare uccisione di obiettivi multipli che presentano diverse concentrazioni e diversi tipi di epitopi peptidici, che è necessario per consentire parametri qualitativi quali avidity funzionale e la variante epitopi cross-reattività da valutare. Questi test inoltre non forniscono alcuna informazione sui cellulari mediate risposte T CD4 +.
Per superare molte delle limitazioni con metodi attualmente utilizzati per valutare le risposte delle cellule T, abbiamo recentemente sviluppato un saggio multiplex basato su array fluorescenti bersaglio (ALS), che permette il controllo delle risposte delle cellule T contro> 250 cellule bersaglio contemporaneamente in un animale da citometria a flusso 1, 2. Accordi di libero scambio sono costituiti da linfociti marcati con SEVLe concentrazioni rali e combinazioni di coloranti vitali come CFSE, CTV e CPD permettendo> 250 gruppi di cellule di fluorescenza unico da generare. Poiché queste cellule rimangono vitali e completamente funzionale, possono essere iniettati in animali per consentire il monitoraggio della loro interazione con le cellule T effettrici in vivo 3. Ad esempio, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe I-binding per consentire la valutazione di antigene-specifica uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio 1. Inoltre, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe II-legame, che permetta di valutare antigene specifico per le cellule T helper (T H) L'attività valutando attivazione (mediante la valutazione dei marcatori di attivazione quali CD69, CD44 e / o CD62L) delle cellule B all'interno della zona di libero scambio recanti peptide cognate 2. Da più di 250 obiettivi possono essere rilevati simultaneamente, è possibile misurare le risposte CTL e T H contro molti gruppi di cellule bersaglio pulsate con npeptidi umerous a diverse concentrazioni e l'inclusione di molti replicati. Il test FTA prevede pertanto un livello senza precedenti di T effettrici delle cellule valutazione della risposta in vivo.
Qui si descrive in dettaglio la costruzione di un FTA e mostrare come possono essere applicati a valutare le risposte delle cellule T in vivo. La procedura descrive la costruzione di un FTA composto di 252 gruppi di cellule distinguibili attraverso l'uso di tre coloranti vitali, composti da 6 ripetizioni di 42 gruppi di cellule pulsate con MHC di classe I e II peptidi leganti. L'etichettatura dei 42 gruppi di cellule avviene in 10 ml a fondo conico tubi ed è utile per fissare questi fuori in un rack tubo, come indicato nella Tabella 1. Questo metodo può essere regolata per piccoli numeri di cluster distinguibili come richiesto riducendo la quantità di etichettatura di ciascun colorante eseguita 1.
Si evidenzia l'utilità del test, mostrando come si può misurare responses generati da ricombinante vaccinazione pox virus contro diversi epitopi in una piccola coorte di topi. Questo mostra come il test FTA può essere utilizzato per misurare le risposte cumulative e avidità funzionale attraverso, rispettivamente, l'uso di area sotto la curva (AUC) valutazioni e misurare la concentrazione di peptide efficace necessaria per generare risposte massime mezzo (EC 50).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il vantaggio di saggi basati FTA è che permettono la discriminazione di> 250 popolazioni di cellule bersaglio valida e perfettamente funzionante da un unico animale ospite mediante citometria a flusso. Questo fornisce un livello di complessità vivo flusso saggi in base citometria a che non è stato possibile prima. Ciò è evidenziato nei due esperimenti sugli animali indicati sopra, dove le risposte alle 7 epitopi virali distinte a 6 concentrazioni potrebbero essere monitorati in replicati di 6 c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal progetto Sovvenzioni # 1010395 (BQ e CP) e # 525431 (CR), e un programma di sovvenzioni # 455395 (CP) dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche in Australia, un Centro australiano per l'epatite e HIV Virologia EOI 2012 borsa di studio (CR e RJJ) e una sovvenzione da parte del Bootes Fondazione Gordon e Gretel (BQ e CR). Desideriamo ringraziare Harpreet Vohra e Michael Devoy per la loro eccellente mantenimento del laboratorio JCSMR FACS, Facility australiano Cancer Research Foundation Biomolecolare Resource, JCSMR, ANU, per la sintesi peptidica, e il Dr. David Boyle, CSIRO Laboratories Salute animale, Geelong, Australia per fornire le madri HIV scorte di vaccini.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
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