組み合わせたDNA-RNA蛍光<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、
Summary
in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。
Abstract
in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞中の核酸の検出を可能にする分子技術である。 DNAのFISHは、多くの場合、細胞遺伝学および癌の診断に使用され、多くの場合、重要な臨床的意義を有するゲノムの異常を検出することができる。 RNA FISHは、細胞内でRNA分子を検出するために使用することができ、遺伝子発現の調節において重要な洞察を提供した。同じセル内でDNAとRNA FISHを組み合わせることにより、DNAのFISHに適した条件が壊れ、一本鎖RNA分子に対する厳しすぎるかもしれないような、技術的に困難である。ここでは、X染色体にコードされるのXist RNAとDNAの複合、同時検出を可能にし、容易に適用可能なプロトコルを提示する。この結合されたDNA-RNA FISHプロトコルは、おそらくRNAとDNAの両方を検出する必要がある他のシステムに適用することができる。
Introduction
蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用いて細胞や組織を研究することは、1、1970年代後半に導入されて以来、細胞内レベルでのクロマチン組織と遺伝子発現、研究者は遺伝子を研究することができました。 DNAのFISHは、しばしば細胞遺伝学、核型2、癌診断3と着床前遺伝子検査4で使用され、それはそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にするので、分子の研究5-6において重要な役割を有している。 RNA FISHによる単一細胞発現解析は、天然の一次転写産物を検出することができるし、非コードRNAは、染色体から転写され、例えばを含む集団レベルでの遺伝子発現を評価する他の技術に利点を提供する定量的RT-PCR、ゲノムワイド発現分析またはノーザンブロッティング。それらの起源部位から直接由来するRNA転写産物を可視化することにより、例えばあった遺伝子発現は7確率的であり、時には8対立遺伝子特異的であることができることに気づいた。技術の改善はあっても、細胞9月11日内の単一mRNA分子の検出および定量を可能にした。
FISHの基本原理は非常に特異的ワトソンとクリックの塩基対形成によって、核酸プローブに細胞内の核酸のハイブリダイゼーションで構成されています。プローブは、顕微鏡的に可視化することができるシグナルを生じる、直接的または間接的に検出することができる。最初の試みは、安全性の問題、制限された空間分解能と時間12月14日に1つだけの標的を検出する能力に基づいて欠点を持っていた放射性標識プローブ、から構成されていた。蛍光色素、ハプテン、および酵素などの非放射性標識のその後の開発は、ルーチン的な分子生物学技術としてFISHの普及使用を可能にした。 FISHプローブは、直接的fluorochで標識することができる核酸の蛍光分子の化学結合によるromes 15及び蛍光標識ヌクレオチドの組込み16-19配列、またはプローブを間接的にコンジュゲートしたハプテン特異的抗体によって（ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む）ハプテンの統合およびハプテンの免疫学的検出の後に可視化することができる蛍光レポーターは、20〜21の分子が含まれる。後者のアプローチは、元の信号を増強するために使用される蛍光標識された抗体のいくつかの層を用いてシグナル増幅を可能にし、低レベルで発現されるRNA種の検出を可能にする。直接的および間接的な標識技術および種々のハプテンを組み合わせることによって、いくつかのターゲットが同時に同じ細胞内で可視化することができる。
FISHプロトコルにおける最も重要な工程の一つは、その標的へのプローブのハイブリダイゼーションである。理論的には、プローブは、具体的には、実際には、唯一のその標的へのこの特異的に結合するであろうがプローブは相同領域に結合すること、およびハイブリダイゼーション条件は、常に特定のDNA領域またはRNA種のための理想的ではないでしょう、いつものように、達成されない。それらはFISH手順のストリンジェンシーを増加させることができ、背景雑音の高レベルをもたらすFISHプローブの非特異的結合を防止することができるように、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、したがって、特に重要である。 RNA分子は、一本鎖されると、それらは容易にFISHプローブにハイブリダイズすることができる。対照的に、二本鎖DNA分子は、第一プローブがハイブリダイズすることができ、その後の変性工程を必要とする。これは、通常、DNAの変性をもたらす試料の加熱によって達成される。しかし、これらの過酷な条件下では、壊れやすい、一本鎖RNA分子が失われる可能性があります。したがって、合わせたDNA-RNA FISH条件の有意な最適化を必要とし、唯一のRNAまたはDNAの分離検出と比較して、より技術的に困難である。
ここでは、プレゼン私たちは、雌マウスの胚性幹細胞の22〜24の差別化X染色体の不活性化（XCI）を研究することができました組み合わせて、同時DNA-RNA魚TA詳細なプロトコル。 XCIは、女性の胚発生25のために重要なエピジェネティック機構であり、ヘテロクロマチンをもたらし、ひいては女性の個体では2本のX染色体の1 26〜27のサイレン。このプロセスに不可欠RNF12 22〜23とREX1 24タンパク質によって制御されている非コードRNAはXistの 28〜30は 、ある。Xistの発現は、胚発生中またはin vitroでのES細胞の分化の際に、将来の不活性X染色体（XI）にアップレギュレートになる、およびX染色体に沿って広がり、それによってX染色体31の転写シャットダウンするクロマチンリモデリング酵素を引き付けることができる。このXistの RNAの広がりは、X染色体のコーティングとしてRNA FISHによって可視化することができるいくつものXist雲とも呼ばれる。女性のES細胞は、ゲノム不安定性に起因し、そのX染色体の1を失う可能性がありますので、他は唯一の核型、安定した細胞は、この重要なプロセス22,32の分析で評価していることを確認するために、XCIを研究するために結合するDNA-RNA魚を採用している-34。すべての分子生物学技術と同様に、いくつかの異なるプロトコルが優れた35-38を公開されている。ここでは、プローブのハイブリダイゼーション、透過処理およびその後のプローブの取り込みを可能にするために、マウスES細胞、細胞の固定、ニックトランスレーションによるFISHプローブを標識する、固定された細胞の前処理における分化誘導から始めて、我々の方法を提示ターゲット、そして最終的に蛍光標識した抗体によるプローブの検出。プロトコルは提示され、ここには2日間の期間内のXist RNA及びX染色体の忠実な検出を可能にし、この技術の基本はそうOTに適合させることができる彼女のシステムや研究の分野。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNAの魚に適した条件が少なく、安定したRNA分子のためにあまりにも過酷なように組み合わせたDNA-RNA FISHは、技術的に挑戦することができます。いくつかのアプローチは、DNAおよびRNAの両方を検出するプローブとの同時インキュベーションの必要性を回避し、同じ細胞においてDNA及びRNAの両方を研究するために適用されている。例えば、重畳アプローチにおいて、最初のRNA FISHが行われ、細胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
Materials
| female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
| mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
| ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| falcon tubes | Falcon | 352196 | |
| 24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
| absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
| RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
| sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
| biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| sterilized cotton | |||
| eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
| HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
| object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
| 10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
| denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2M Tris pH 7.5 solution | |||
| Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
| 10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
| Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
| BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
| rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
| donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| nail-varnish | |||
| fluorescent miscroscope |
References
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