Kombinert DNA-RNA Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) for å studere X kromosom inaktivering i Differensiert Kvinne Mouse Embryonale stamceller

Summary

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) tillater påvisning av nukleinsyrer i sitt opprinnelige miljø i cellene. Vi beskriver her en protokoll for det kombinerte, samtidig påvisning av RNA-og DNA ved hjelp av FISH, som kan brukes til å studere X-kromosom inaktivering i mus embryonale stamceller.

Abstract

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er en molekylær teknikk som muliggjør påvisning av nukleinsyrer i celler. DNA FISH er ofte brukt i cytogenetikk og kreftdiagnostikk, og kan oppdage avvik av genomet, som ofte har viktige kliniske implikasjoner. RNA FISH kan brukes for å påvise RNA molekyler i celler og har gitt viktig innsikt i reguleringen av genekspresjon. Kombinere DNA og RNA FISH innen samme celle er teknisk utfordrende, ettersom forholdene er egnet for DNA FISH kan være for tøffe for skjøre, single strandet RNA-molekyler. Vi her presentere en lett anvendelig protokoll som gjør den kombinerte, samtidig påvisning av Xist RNA og DNA kodet av X-kromosomet. Denne kombinerte DNA-RNA FISH-protokollen kan sannsynligvis bli anvendt med andre systemer hvor både RNA-og DNA må bli detektert.

Introduction

Studerer celler og vev ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) har siden introduksjonen i slutten av 1970-tallet ^en, tillot forskerne å studere gener, kromatin organisasjon og genekspresjon på subcellulært nivå. DNA FISH er hyppig brukt i cytogenetikk, karyotyping ^2, kreftdiagnostikk ³ og pre-implantasjon genetisk screening ^fire, og har en viktig rolle i molekylær forskning ^5-6 siden det tillater påvisning av nukleinsyrer i sitt opprinnelige miljø. Enkelt celle uttrykk analyse av RNA FISH kan oppdage innfødte primære transkripsjoner og noncoding RNA transkribert fra kromosomer, og gir fordeler til andre teknikker som vurdere genuttrykk på befolkningsnivå, herunder for eksempel kvantitativ RT-PCR, genom bredt uttrykk analyse eller Northern blotting . Ved å visualisere RNA transkripsjoner som stammer direkte fra sine områder av opprinnelse, har det for eksempel værtlagt merke til at genuttrykk er stokastisk ^7, og kan noen ganger være allel spesifikk ^åtte. Forbedringer i teknikken har engang lov påvisning og kvantifisering av enkelt mRNA molekyler i cellene ^9-11.

Det grunnleggende prinsipp for FISH består av hybridisering av nukleinsyrer i cellen til en nukleinsyre-probe ved hjelp av meget spesifikke Watson og Crick baseparing. Sonden kan være enten direkte eller indirekte påvist, noe som resulterer i et signal som kan mikroskopisk visualiseres. Innledende forsøk besto av radioaktivt merkede prober, som hadde ulemper basert på sikkerhet, begrensede romlig oppløsning og muligheten for å detektere bare en target i en tid ^{av 12-14.} Den videre utviklingen av ikke-radioaktive merkelapper, inkludert fluorokromer, haptener og enzymer, har tillatt den store spredningen bruk av fisk som en rutine molekylærbiologi teknikk. FISH probe kan enten være direkte merket med fluorochromes ved kjemisk binding av fluorescerende molekyler til nukleinsyresekvenser ¹⁵ og integrering av fluorescensmerkede nukleotider ^{16 til 19,} eller sonden indirekte kan visualiseres etter integrasjon av haptener (inkludert biotin og Digoxigenin) og immunologisk påvisning av haptener ved hapten-spesifikke antistoffer konjugert til fluorescerende reporter molekyler ^20-21. Sistnevnte tilnærming tillater signalforsterkning ved hjelp av flere lag av fluorescensmerkede antistoffer som anvendes for å forsterke det opprinnelige signal, og muliggjør deteksjon av RNA-arter som er uttrykt på lave nivåer. Ved å kombinere direkte og indirekte merkingsteknikker og forskjellige haptener, kan flere mål samtidig bli visualisert innenfor den samme cellen.

Et av de viktigste trinn i fisk protokoller er hybridiseringen av proben til målet. Selv om i teorien, vil en sonde spesifikt binder bare til målet, i praksis er dette spesifisiteter ikke alltid oppnådd, som prober kan binde seg til homologe regioner, og hybridiseringsbetingelser vil ikke alltid være ideelt for en viss DNA region eller RNA arter. Post-hybridiserings vasker er derfor av særlig betydning, da de kan øke stringensen av FISH prosedyre, og kan forhindre ikke-spesifikk binding av fiske prober, noe som ville resultere i et høyt nivå av bakgrunnsstøy. Som RNA-molekyler blir enkelt-trådet de lett kan hybridiseres til en probe FISK. I motsetning til dette må den dobbelt-trådet DNA-molekyl først et denatureringstrinn, hvoretter en probe kan hybridisere. Dette oppnås vanligvis ved oppvarming av prøven, hvilket resulterer i denaturering av DNA. Men under disse harde forholdene, skjøre, single strandet RNA-molekyler kan være tapt. Derfor krever kombinert DNA-RNA FISH vesentlig optimalisering av forholdene, og er mer teknisk krevende sammenlignet med separat deteksjon av bare RNA eller DNA.

Her har vi presenTA detaljert protokoll for kombinert, samtidig DNA-RNA FISH som har tillatt oss å studere X kromosom inaktivering (XCI) i differensierende kvinnelige mus embryonale stamceller ^22-24. XCI er en avgjørende epigenetisk mekanisme for kvinnelig embryoutvikling ^25, og resulterer i heterochromatinization og dermed stanse av en av de to X-kromosom i kvinnelige individer ^26-27. Essential til denne prosessen er det kodende RNA Xist ^28-30, som er regulert av RNF12 ^22-23 og Rex1 ²⁴ proteiner. Xist uttrykk blir oppregulert på fremtiden inaktive X-kromosom (Xi) under embryonal utvikling eller ved ES celledifferensiering in vitro , og kan spre seg langs X-kromosom og dermed tiltrekke kromatin remodeling enzymer som fører til transkripsjons nedleggelse av X kromosom ^31. Denne spredning av Xist RNA kan visualiseres ved RNA FISH som et belegg av X chromonoe, som også er referert til som en Xist sky. Siden kvinnelige ES celler kan miste en av sine X-kromosomer grunn genomisk ustabilitet, har vi og andre næringsdrivende kombinert DNA-RNA FISH å studere XCI, for å sørge for at bare karyotypically stabile celler blir vurdert i analysen av denne viktige prosessen ^{22,32 -34.} Som med hver molekylærbiologi teknikken flere forskjellige gode protokoller har blitt publisert, ^35-38. Her presenterer vi foreliggende fremgangsmåte, som starter fra induksjon av differensiering i mus ES-celler, fiksering av celler, merking av fisk prober ved nick-translasjon, forbehandling av faste celler til å tillate permeabilization og påfølgende probe opptak, hybridisering av proben til målet, og til sist detekteringen av proben med fluorescensmerkede antistoffer. Den her presenteres protokollen lar den trofaste påvisning av Xist RNA og X-kromosomet i en periode på to dager, og det grunnleggende av denne teknikken kan trolig tilpasses othennes systemer og forskningsområder.

Protocol

En. Induksjon av Differensiering i Kvinne embryonale stamceller til Fremkall X kromosom inaktive MERK: Kvinnelige mus embryonale stamceller (tilgjengelig på forespørsel) er dyrket under standard ES celle forhold på gelatin kultur retter belagt med mus embryonale fibroblaster (MEFs). Vi her anta at leseren er kjent med standard celle kultur teknikker 39-41. For å indusere differensiering, vil ES-celler dyrket i T25 retter skilles fra MEFs, og vil bli belagt i differensieringsmedi…

Representative Results

Ved hjelp av de ovennevnte protokoll for kombinerte DNA-RNA FISH, har vi vært i stand til å visualisere X inaktive i differensierende hunn embryonale stamceller. Figur 1 viser et representativt eksempel på en DNA-RNA FISH eksperiment, hvor vi har oppdaget både Xist (som er synlig som en såkalt Xist RNA skyen på inaktive X-kromosomet, og en basal transkripsjon presisere på den aktive X-kromosomet), og et område av X-kromosomet, som er synlig som et ubetydelig signal. Legg merke …

Discussion

Kombinert DNA-RNA FISH kan være teknisk utfordrende, ettersom forholdene er egnet for DNA FISH kan være for tøffe for mindre stabile RNA-molekyler. Flere tilnærmingsmåter har blitt anvendt for å studere både DNA og RNA i samme celle, omgå behovet for samtidig inkubering med prober som detekterer både DNA og RNA. For eksempel, i en overlagring metode, blir først RNA FISH utføres, og cellene blir fotografert, og koordinatene er tatt. Deretter blir de samme slides brukt for DNA FISH, der signalet fra RNA FISH g?…

Materials

female mouse embryonic stem cells			will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts			can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore
ES cell culture medium			DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Fetal Calf Serum	Invitrogen	10099141
Penicillin–streptomycin (100×)	Invitrogen	15140-122
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140-050
ß-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES cell differentiation medium			IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 cell culture dishes	Greiner Bio-one	690160
6-well cell culture dishes	Greiner Bio-one	662160
cell culture grade PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS	Gibco	25200-056
falcon tubes	Falcon	352196
24×24 mm coverslips	Menzle	780882
gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC
absolute 100%  ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L	use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water	Baxter	TKF7114
sterile filter tips	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)	Roche	11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml syringe	BD Plastipak	300013
sterilized cotton
eppendorf tubes	Eppendorf	30120086
yeast tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
mouse cot-1 DNA  1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
2M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ hybridization solution			50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide	Acros organics	3272350000
dextran sulfate	Fluka	31403
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml
HCL, 37% solution	Fluka	84422
object glasses	Starfrost	8037/1
20x SSC	Invitrogen	AM9763	dilute to 2x SSC in RNAse free water
10 mM Phosphate buffer, pH 7			add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer			70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2M Tris pH 7.5 solution
Tris-Saline-Tween washing solution (TST)			100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter
10x Saline solution			dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave
Tris-Saline-BSA (TSBSA)			500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x	New England Biolabs	B9001S
sheep-anti-dig antibody	Roche diagnostics		use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody	Roche diagnostics		use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-Saline washing solution (TS)			10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
nail-varnish
fluorescent miscroscope