ADN-ARN combinado fluorescente<em> In situ</em> La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Summary

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

Abstract

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que permite la detección de ácidos nucleicos en las células. FISH de ADN se utiliza a menudo en la citogenética y el diagnóstico del cáncer, y puede detectar aberraciones del genoma, que a menudo tiene importantes implicaciones clínicas. ARN FISH se puede usar para detectar moléculas de ARN en las células y se ha proporcionado información importante en la regulación de la expresión génica. La combinación de ADN y ARN FISH dentro de la misma célula es técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN de pescado podría ser demasiado fuertes para moléculas de ARN de cadena simple frágiles. Damos a conocer un protocolo de fácil aplicación que permite a la combinada, la detección simultánea de Xist ARN y el ADN codificado por los cromosomas X. Este protocolo FISH de ADN-ARN combinado probable que se puede aplicar a otros sistemas en los que necesitan tanto ARN como ADN para ser detectado.

Introduction

El estudio de las células y los tejidos mediante hibridación in situ fluorescente (FISH), desde su introducción a finales de 1970 ^1, permite a los investigadores estudiar los genes, la organización de la cromatina y la expresión génica a nivel subcelular. FISH ADN se utiliza con frecuencia en citogenética, cariotipo ^2, el diagnóstico del cáncer ³ y antes de la implantación de cribado genético ^4, y tiene un papel importante en la investigación molecular ^{de 5-6,} ya que permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo. Análisis de la expresión de células individuales por ARN FISH puede detectar transcritos primarios nativas y RNAs no codificantes que se transcribe a partir de cromosomas, y ofrece ventajas a otras técnicas que evalúan la expresión génica a nivel de población, incluyendo, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, análisis de expresión de todo el genoma o transferencia Northern . Mediante la visualización de las transcripciones de ARN procedentes directamente de sus sitios de origen, ha sido, por ejemplo,se dio cuenta de que la expresión génica es estocástico ^7, y, a veces puede ser específica de alelo ^8. Las mejoras en la técnica incluso han permitido la detección y cuantificación de moléculas de ARNm individuales dentro de las células ^9-11.

El principio básico de peces consiste en la hibridación de ácidos nucleicos dentro de la célula a una sonda de ácido nucleico por medio de Watson y Crick de apareamiento de bases altamente específica. La sonda puede ser ya sea directa o indirectamente detectado, dando como resultado una señal que puede ser visualizada microscópicamente. Los intentos iniciales consistieron de sondas marcadas radiactivamente, que tenían inconvenientes sobre la base de las cuestiones de seguridad, resolución espacial limitada y la capacidad de detectar sólo un objetivo a la vez ^12-14. El desarrollo posterior de las etiquetas no radiactivos, incluidos fluorocromos, haptenos, y enzimas, ha permitido que el uso generalizado de FISH como una técnica de biología molecular de rutina. La sonda FISH o bien se puede marcar directamente con fluorochromes por reticulación química de moléculas fluorescentes a secuencias de ácido nucleico ¹⁵ y la integración de los nucleótidos marcados con fluorescencia ^16-19, o la sonda puede ser visualizada indirectamente después de la integración de haptenos (incluyendo biotina y digoxigenina) y detección inmunológica de haptenos por anticuerpos específicos conjugados con haptenos reportero fluorescente moléculas ^20-21. El último enfoque permite la amplificación de la señal mediante el uso de varias capas de anticuerpos marcados con fluorescencia que se utilizan para mejorar la señal original, y permite la detección de especies de ARN que se expresan en niveles bajos. Mediante la combinación de técnicas de etiquetado directos e indirectos y diversos haptenos, varios objetivos se pueden visualizar simultáneamente dentro de la misma célula.

Uno de los pasos más importantes en los protocolos de pescado es la hibridación de la sonda con su diana. Aunque, en teoría, una sonda específicamente se unirá sólo a su objetivo, en la práctica, esta especificidadno siempre es logrado, como sondas pueden unirse a regiones homólogas, y condiciones de hibridación no siempre será ideal para una especie determinada región de ADN o de ARN. Los lavados post-hibridación son por lo tanto de particular importancia, ya que pueden aumentar el rigor del procedimiento de FISH, y pueden prevenir la unión no específica de sondas FISH, que daría lugar a un alto nivel de ruido de fondo. Como las moléculas de ARN son de cadena simple que puede ser fácilmente hibridó con una sonda de FISH. En contraste, la molécula de ADN de doble hebra primero necesita una etapa de desnaturalización, después de lo cual una sonda se puede hibridar. Esto se consigue normalmente por calentamiento de la muestra, lo que resulta en la desnaturalización del ADN. Sin embargo, bajo estas duras condiciones, moléculas de ARN de cadena simple frágiles podrían perderse. Por lo tanto, ADN-ARN combinado FISH requiere la optimización significativa de las condiciones, y es técnicamente más difícil en comparación con la detección separada de sólo ARN o ADN.

Aquí Presenta protocolo detallado de combinado, FISH simultánea de ADN-ARN que ha permitido estudiar la inactivación del cromosoma X (XCI) en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hembra ^22-24. XCI es un mecanismo epigenético crucial para el desarrollo embrionario hembra ^25, y los resultados en heterochromatinization y por lo tanto, el silenciamiento de uno de los dos cromosomas X en individuos femeninos ^26-27. Esencial para este proceso es el ARN no codificante de Xist ^28-30, que está regulada por los RNF12 ^22-23 y REX1 ²⁴ proteínas. Expresión de Xist se convierte en upregulated en el futuro cromosoma X inactivo (XI) durante el desarrollo embrionario o la diferenciación de células ES in vitro , y pueden expandirse a lo largo del cromosoma X y, por tanto atraer enzimas remodelación de la cromatina que se traducen en el cierre de la transcripción del cromosoma X ^31. Esta difusión de Xist ARN pueden ser visualizados por ARN FISH como un revestimiento de la cromosoma Xalgunos, que también se conoce como una nube de Xist. Dado que las células madre embrionarias femeninas pueden perder uno de sus cromosomas X, debido a la inestabilidad genómica, nosotros y otros han empleado combinado de ADN-ARN FISH para estudiar XCI, para asegurarse de que las células sólo cariotípicamente estables son evaluados en el análisis de este importante proceso ^{22,32 -34.} Al igual que con todas las técnicas de la biología molecular, varios protocolos excelentes diferentes han sido publicados ^35-38. Aquí presentamos nuestro método, a partir de la inducción de la diferenciación en células ES de ratón, la fijación de las células, el etiquetado de sondas FISH por traslación de mella, el tratamiento previo de las células fijadas para permitir la permeabilización y captación de sonda posterior, la hibridación de la sonda a la objetivo, y finalmente la detección de la sonda por anticuerpos marcados con fluorescencia. El protocolo aquí presentado permite la fiel detección de Xist ARN y el cromosoma X dentro de un período de dos días, y los fundamentos de esta técnica probablemente se puede adaptar a otsus sistemas y áreas de investigación.

Protocol

1. Inducción de la diferenciación de células madre embrionarias Mujer para inducir inactivación del cromosoma X NOTA: las células madre embrionarias de ratones hembra (disponibles bajo petición) se cultivan en condiciones normales de células ES en placas de cultivo gelatinizados recubiertas con fibroblastos de embriones de ratón (MEFs). Estamos aquí, suponemos que el lector está familiarizado con las técnicas de cultivo celular convencionales 39-41. Para inducir la difere…

Representative Results

Usando el protocolo antes mencionado para combinado de ADN-ARN FISH, hemos sido capaces de visualizar inactivación del cromosoma X en la diferenciación de células madre embrionarias femeninas. Figura 1 muestra un ejemplo representativo de un experimento FISH de ADN-ARN, donde se detectó tanto Xist (que es visible como una llamada de Xist ARN nube en el cromosoma X inactivo y un puntito basal de transcripción en el cromosoma X activo), y una región del cromosoma X, que es visible …

Discussion

Combinado de ADN-ARN FISH puede ser técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN FISH pueden ser demasiado fuertes para las moléculas de ARN menos estables. Varios enfoques se han aplicado al estudio de ambos ADN y el ARN en la misma célula, evitando la necesidad de incubación simultánea con sondas de detectar tanto el ADN y el ARN. Por ejemplo, en un enfoque de superposición, se realiza primero FISH ARN y las células son expuestas, y se toman las coordenadas. Posteriormente, los mismos por…

Materials

female mouse embryonic stem cells			will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts			can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore
ES cell culture medium			DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Fetal Calf Serum	Invitrogen	10099141
Penicillin–streptomycin (100×)	Invitrogen	15140-122
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140-050
ß-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES cell differentiation medium			IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 cell culture dishes	Greiner Bio-one	690160
6-well cell culture dishes	Greiner Bio-one	662160
cell culture grade PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS	Gibco	25200-056
falcon tubes	Falcon	352196
24×24 mm coverslips	Menzle	780882
gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC
absolute 100%  ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L	use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water	Baxter	TKF7114
sterile filter tips	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)	Roche	11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml syringe	BD Plastipak	300013
sterilized cotton
eppendorf tubes	Eppendorf	30120086
yeast tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
mouse cot-1 DNA  1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
2M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ hybridization solution			50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide	Acros organics	3272350000
dextran sulfate	Fluka	31403
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml
HCL, 37% solution	Fluka	84422
object glasses	Starfrost	8037/1
20x SSC	Invitrogen	AM9763	dilute to 2x SSC in RNAse free water
10 mM Phosphate buffer, pH 7			add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer			70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2M Tris pH 7.5 solution
Tris-Saline-Tween washing solution (TST)			100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter
10x Saline solution			dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave
Tris-Saline-BSA (TSBSA)			500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x	New England Biolabs	B9001S
sheep-anti-dig antibody	Roche diagnostics		use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody	Roche diagnostics		use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-Saline washing solution (TS)			10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
nail-varnish
fluorescent miscroscope