Gecombineerde DNA-RNA-TL<em> In situ</em> Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Summary

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Abstract

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de detectie van nucleïnezuren in cellen mogelijk maakt. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica en kankerdiagnostiek en kunnen afwijkingen van het genoom, die vaak belangrijke klinische implicaties detecteren. RNA FISH kunnen worden gebruikt om RNA-moleculen te detecteren in cellen en heeft belangrijke inzichten in regulatie van genexpressie verschaft. De combinatie van DNA en RNA FISH binnen dezelfde cel is technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor fragiele, enkelstrengs RNA-moleculen zou kunnen zijn. We stellen hier een gemakkelijk toepasbare protocol dat de gecombineerde gelijktijdige detectie van Xist RNA en DNA gecodeerd door de X-chromosomen mogelijk maakt. Deze gecombineerde DNA-RNA FISH protocol kan waarschijnlijk worden toegepast op andere systemen waar zowel RNA als DNA moeten worden gedetecteerd.

Introduction

Studeren cellen en weefsels door middel van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is sinds de invoering ervan in de late jaren 1970 ^1, mogen onderzoekers genen, chromatine organisatie en de genexpressie te bestuderen op het subcellulaire niveau. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica, karyotypering ^2, kankerdiagnostiek ³ en pre-implantatie genetische screening ^4, en heeft een belangrijke rol in moleculair onderzoek ^5-6 aangezien het de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving. Enkele cel expressie analyse op RNA FISH kunnen inheemse primaire transcripten en niet-coderende RNA's worden afgeschreven van chromosomen, en biedt voordelen voor andere technieken die op populatieniveau genexpressie te beoordelen, met inbegrip van bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR, genoom-wijde expressie analyse of Northern blotting . Door het visualiseren van RNA-transcripten die rechtstreeks afkomstig zijn van hun sites van herkomst, heeft het bijvoorbeeld geweestgemerkt dat genexpressie stochastische ⁷ en soms allelspecifieke ⁸ zijn. Verbeteringen in de techniek zijn ook toegestaan ​​de detectie en kwantificering van afzonderlijke mRNA-moleculen in de cellen ^9-11.

Het basisprincipe van FISH bestaat uit hybridisatie van nucleïnezuren in de cel een nucleïnezuur probe door zeer specifieke Watson en Crick baseparing. De probe kan direct of indirect gedetecteerd, waardoor een signaal dat microscopisch kan worden gevisualiseerd. Initiële pogingen bestond uit radioactief gemerkte probes die nadelen had gebaseerd op veiligheid, beperkte ruimtelijke resolutie en de mogelijkheid om slechts een doelwit tegelijk ^12-14. De verdere ontwikkeling van niet-radioactieve labels, waaronder fluorochromen, haptenen, en enzymen, heeft geleid tot de brede verspreiding gebruik van FISH als een routine moleculaire biologie techniek. De FISH probe kan direct worden gelabeld met fluorochromes door chemische koppeling van fluorescerende moleculen nucleïnezuur sequenties ¹⁵ en integratie van fluorescent gemerkte nucleotiden ^16-19, of de sonde kan indirect worden gevisualiseerd na integratie van haptenen (zoals biotine en digoxigenine) en immunologische detectie van haptenen met hapteen antilichamen geconjugeerd aan fluorescerende reportermoleculen ^20-21. Deze aanpak maakt signaalversterking door verscheidene lagen fluorescerend gemerkte antilichamen die worden gebruikt om het originele signaal te versterken, en maakt de detectie van RNA-soorten die worden uitgedrukt op lage niveaus. Door directe en indirecte labeling technieken en diverse haptenen kunnen meerdere doelen gelijktijdig worden gevisualiseerd binnen dezelfde cel.

Een van de belangrijkste stappen in FISH protocollen is de hybridisatie van de probe aan het doelwit. Hoewel in theorie een probe specifiek alleen binden aan zijn doel in praktijk specificiteitniet altijd bereikt, als probes binden aan homologe gebieden en hybridisatieomstandigheden niet altijd ideaal voor een bepaalde DNA-gebied of RNA soort. Post-hybridisatie wassingen zijn daarom van bijzonder belang, aangezien zij de stringentie van de FISH procedure kan verhogen, en kan voorkomen dat niet-specifieke binding van FISH probes die resulteert in een hoge mate van achtergrondgeluiden. Als RNA-moleculen enkel zijn gestrand zij gemakkelijk kunnen worden gehybridiseerd met een FISH probe. In tegenstelling, het dubbelstrengs DNA-molecuul heeft een eerste denaturatiestap, waarna een probe hybridiseren. Dit wordt gewoonlijk bereikt door verhitting van het monster, waardoor denaturatie van het DNA. Echter, onder deze zware omstandigheden, breekbaar, enkelstrengs RNA-moleculen kunnen verloren gaan. Daarom gecombineerde DNA-RNA FISH vereist aanzienlijke optimalisering van de omstandigheden en is technisch uitdagend vergelijking met de afzonderlijke detectie van enkel RNA of DNA.

Hier presentatie weta gedetailleerd protocol van gecombineerde, gelijktijdige DNA-RNA FISH die heeft ons toegestaan ​​om X-chromosoom inactivatie (XCI) studeren in het onderscheiden vrouwelijke muis embryonale stamcellen ^22-24. XCI is een cruciaal epigenetisch mechanisme voor vrouwelijke embryonale ontwikkeling ^25, en resulteert in heterochromatinization en dus zwijgen van een van de twee X-chromosomen in vrouwelijke individuen ^26-27. Van essentieel belang om dit proces is het niet-coderende RNA Xist ^28-30, die wordt gereguleerd door de RNF12 ^22-23 en REX1 ²⁴ eiwitten. Xist expressie wordt gereguleerd op de toekomst inactieve X-chromosoom (Xi) tijdens de embryonale ontwikkeling of bij ES celdifferentiatie in vitro en kunnen zich langs de X-chromosoom en daardoor chromatine remodeling enzymen die leiden tot transcriptionele uitschakeling van het X-chromosoom ³¹ te trekken. Deze verspreiding van Xist RNA kan door RNA FISH worden gevisualiseerd als een bekleding van de X-chromosommige, die ook wel een Xist cloud. Aangezien vrouwelijke ES-cellen een van hun X-chromosomen als gevolg van instabiliteit van het genoom kan verliezen, hebben wij en anderen werkzaam gecombineerde DNA-RNA FISH om XCI bestuderen, om ervoor te zorgen dat alleen karyotypisch stabiele cellen worden beoordeeld in de analyse van dit belangrijke proces ^{22,32 -34.} Zoals bij elke moleculaire biologie technieken, hebben verschillende uitstekende protocollen gepubliceerd ^35-38. Hier presenteren we onze werkwijze, uitgaande van de inductie van differentiatie in muizen ES cellen, fixatie van cellen, kenmerken van FISH probes door nick-translatie, voorbehandeling van gefixeerde cellen om permeabilisatie en daaropvolgende opname probe, hybridisatie van de probe aan de doel, en tenslotte detectie van de probe met fluorescent gemerkte antilichamen. De hierin gepresenteerde protocol kan de gelovigen detectie van Xist RNA en het X-chromosoom binnen een termijn van twee dagen, en de basis van deze techniek kan waarschijnlijk worden aangepast aan othaar systemen en onderzoeksgebieden.

Protocol

1. Inductie van differentiatie in vrouwelijke embryonale stamcellen aan X-chromosoom inactivatie Braken OPMERKING: Vrouw muis embryonale stamcellen (op aanvraag) worden geteeld onder standaard ES-cel voorwaarden ontsloten kweekschalen gecoat met muis embryonale fibroblasten (MEF). Wij hier aannemen dat de lezer bekend is met standaard celkweek technieken 39-41. Om differentiatie induceren, wordt ES cellen gekweekt in T25 gerechten worden gescheiden van de MEFs en worden uitgeplaat i…

Representative Results

Met behulp van bovenstaande protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH, konden we X-chromosoom inactivatie visualiseren differentiëren vrouwelijke embryonale stamcellen zijn. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld van een DNA-RNA FISH experiment waarbij we zowel Xist (die herkend zichtbaar als een zogenaamde Xist RNA wolk op het inactieve X-chromosoom en een basale transcriptie lokaliseren op actieve X-chromosoom), en een gebied van het X-chromosoom, die zichtbaar als lokaliseren s…

Discussion

Gecombineerde DNA-RNA vis kan worden technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor minder stabiele RNA-moleculen kunnen worden. Verschillende benaderingen zijn toegepast op zowel DNA als RNA studie in dezelfde cel, omzeilen de noodzaak voor gelijktijdige incubatie met probes detecteren zowel DNA en RNA. Bijvoorbeeld, in een superpositie benadering wordt eerst RNA FISH uitgevoerd en de cellen worden afgebeeld en coördinaten worden genomen. Vervolgens worden dezelfde slides gebruikt…

Materials

female mouse embryonic stem cells			will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts			can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore
ES cell culture medium			DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Fetal Calf Serum	Invitrogen	10099141
Penicillin–streptomycin (100×)	Invitrogen	15140-122
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140-050
ß-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES cell differentiation medium			IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 cell culture dishes	Greiner Bio-one	690160
6-well cell culture dishes	Greiner Bio-one	662160
cell culture grade PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS	Gibco	25200-056
falcon tubes	Falcon	352196
24×24 mm coverslips	Menzle	780882
gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC
absolute 100%  ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L	use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water	Baxter	TKF7114
sterile filter tips	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)	Roche	11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml syringe	BD Plastipak	300013
sterilized cotton
eppendorf tubes	Eppendorf	30120086
yeast tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
mouse cot-1 DNA  1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
2M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ hybridization solution			50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide	Acros organics	3272350000
dextran sulfate	Fluka	31403
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml
HCL, 37% solution	Fluka	84422
object glasses	Starfrost	8037/1
20x SSC	Invitrogen	AM9763	dilute to 2x SSC in RNAse free water
10 mM Phosphate buffer, pH 7			add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer			70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2M Tris pH 7.5 solution
Tris-Saline-Tween washing solution (TST)			100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter
10x Saline solution			dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave
Tris-Saline-BSA (TSBSA)			500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x	New England Biolabs	B9001S
sheep-anti-dig antibody	Roche diagnostics		use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody	Roche diagnostics		use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-Saline washing solution (TS)			10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
nail-varnish
fluorescent miscroscope