زرع الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع في نموذج الفأر
Summary
لتحسين معرفتنا تشكيل neotissue الخلوية والجزيئية، تم تطوير نموذج الفئران من TEVG مؤخرا. تم زرع الطعوم كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. هذا النموذج يحقق نتائج مماثلة لتلك التي تحققت في التحقيق السريرية لدينا، ولكن على مدى تقصير حتى الوقت بالطبع.
Abstract
وغالبا ما تستخدم السقالات المصنفة قابلة للتحلل مع خلايا نخاع العظام وحيدات النوى (خلايا نخاع العظم) لجراحة لعلاج التشوهات الخلقية في القلب. أظهرت النتائج السريرية طويلة المدى في أسعار المباح ممتازة، ولكن، مع انتشار كبير لتضيق. للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية ومنع التنمية تضيق في الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs)، قمنا بتطوير نموذج الفأر من الكسب غير المشروع مع ما يقرب من 1 مم القطر الداخلي. الأولى، تم تجميعها TEVGs من السقالات الأنبوبية القابلة للتحلل ملفقة من محبوكة حمض polyglycolic شعرت شبكة المغلفة مع ε-caprolactone وL-lactide من البوليمرات. والسقالات ثم توضع في مجفاد، بالمكنسة الكهربائية لمدة 24 ساعة، وتخزينها في مجفف حتى بذر الخلية. الثانية، وقد تم جمع نخاع العظم من فئران المانحة وتم عزل الخلايا وحيدات النوى من قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي. الثالث، كان ما يقرب من مليون خليةالمصنفة على السقالة وحضنت O / N. أخيرا، تم السقالات المصنف ثم زرعها كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. أظهرت ترقيع مزروع المباح ممتاز (> 90٪) دون وجود أدلة حدوث مضاعفات الانسداد التجلطي أو تشكيل أمدمي. وهذا نموذج الفئران تساعدنا في فهم وقياس الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue في TEVG.
Introduction
عيوب القلب الخلقية هي الظروف الخطيرة التي تؤثر على ما يقرب من 8٪ من الولادات الحية في الولايات المتحدة. ما يقرب من 25٪ من الرضع الذين يعانون من عيوب خلقية في القلب أو 2.4 لكل 1،000 ولادة حية، تتطلب العلاج الغازية في السنة الأولى من حياتهم 1. العلاج الأكثر فعالية لأمراض القلب الخلقية هو الجراحة الترميمية. للأسف، والمضاعفات الناجمة عن استخدام القنوات المتاحة حاليا الأوعية الدموية هي السبب الأكثر أهمية للمراضة والوفيات بعد الجراحة.
لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير أول الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs) للاستخدام السريري 2. شيدت TEVGs من أنابيب البوليستر القابلة للتحلل المصنف مع نخاع العظم ذاتي الخلايا المستمدة من وحيدات النوى (BM-الشركات المتعددة الجنسيات) وزرع كقنوات الوريدي لجراحة القلب الخلقية. أظهرت النتائج معدلات ممتازة في المباح 1-3 سنوات من المتابعة، ولكن مع انتشار كبير من تضيق <sتصل> 3،4. كان من الواضح أن هناك حاجة إلى فهم أفضل لتشكيل neotissue الأوعية الدموية والآلية الكامنة وراء تطوير TEVG تضيق. من أجل فهم أفضل للتنمية TEVGs وآلية التنمية تضيق، تم إنشاء نموذج الأغنام 5،6. في هذا النموذج، وTEVGs تحولت بنجاح في السفن الذين يعيشون وكانت مشابهة في كل من التشكل وظيفة الأوردة الأصلية. كان هذا الاستخدام نموذج الحيوانات الكبيرة خطوة أولى جيدة في توفير معلومات ما قبل السريرية الهامة التي ساعدت الاستخدام السريري للTEVGs. ومع ذلك، فهم كامل من الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية في TEVGs باستخدام نماذج حيوانية كبيرة محدودة بسبب القيود في التوصيف الجزيئي للخلية الظواهر الأوعية الدموية بسبب نقص أنواع الأدوات الجزيئية محددة. للتغلب على أوجه القصور هذه، تم تطوير نموذج الفئران من TEVGs بسبب التقدم السريع في علم الوراثة والبيولوجيا الماوس الخاصة بهم واسعةص توصيف مع ميزة إضافية تتمثل في مقياس زمني تقصير.
في الفئران IVC نموذج مداخلة لخص بإخلاص عملية neovessel التشكيلة التي تحدث في الحيوانات الكبيرة والبشر، ولكن مع مرور دورة زمنية أقصر بكثير 6-9. هنا، بروتوكول مفصلة لتصنيع الكسب غير المشروع على نطاق ضيق باستخدام السقالات القابلة للتحلل، وصفت حصاد BM-MNC والعزلة، BM-MNC البذر على السقالة، وزرع الفساد في نموذج الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الفأر من TEVG هو أداة قيمة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue وتطوير تضيق. وقد أظهرت المصنف BM-MNC في كل من الصور النسيجية ووزارة شؤون المرأة من الخلايا المصنفة على الكسب غير المشروع 11. وقد أظهرت كفاءة البذر الخلية أيضا باستخدام فحص الحمض النووي 7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء منها عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (RO1 HL098228) لCKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| ɛ-caprolactone and L- lactide copolymer P(LA/CL) |
Gunze Inc. | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24 well plate | Corning | 3526 | |
| 15cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | gibco | 14190-144 | |
| Littauer Bone Cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
- Heart Association, A. m. e. r. i. c. a. n. Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin’oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
