En Metode til Permeabilisering af<em> Drosophila</em> Embryoner til Analyser af Small Molecule Activity
Summary
Indførelse af små molekyler til at udvikle Drosophila embryo et stort potentiale til at karakterisere den biologiske aktivitet af nye forbindelser, lægemidler og toxiner samt til sondering grundlæggende udviklingsmæssige veje. Heri beskrevne metoder skitsere skridt at overvinde naturlige barrierer for denne tilgang, udvide nytten af Drosophila embryo model.
Abstract
The Drosophila embryo har længe været en stærk laboratoriemodel til at belyse molekylære og genetiske mekanismer, der styrer udviklingen. Den lette genetiske manipulationer med denne model har fortrængt farmakologiske tilgange, der er almindelige i andre dyremodeller og cellebaserede assays. Her beskriver vi de seneste fremskridt i en protokol, der muliggør anvendelse af små molekyler til det udviklende bananfluen foster. Fremgangsmåden detaljer skridt til at overvinde den uigennemtrængelighed æggeskallen samtidig bevare levedygtigheden foster. Eggshell permeabilisering på tværs af en bred vifte af udviklingsstadier opnås ved anvendelse af en tidligere beskrevet d-limonen embryo permeabilization opløsningsmiddel (EPS 1), og som den aldrende embryoner ved reduceret temperatur (18 ° C), før behandlinger. Desuden er brugen af en langt rødt farvestof (CY5) som en permeabilisering beskrevne indikator, som er kompatibel med efterfølgende anvendelser involverer standard rød og grøn influenzaorescent farvestoffer i levende og faste præparater. Denne protokol gælder for undersøgelser ved hjælp af bioaktive forbindelser til sonde udviklingsmæssige mekanismer samt undersøgelser med henblik på at evaluere teratogene eller farmakologisk aktivitet af ukarakteriserede små molekyler.
Introduction
Drosophila embryo fortsætter med at være en førende model til undersøgelse af grundlæggende mekanismer i udvikling 2. Denne kraftfulde model er understøttet af en bred vifte af molekylære genetiske værktøjer, som tillader manipulation af i det væsentlige enhver gen på noget tidspunkt og inden for ethvert organ under udvikling. Den lille størrelse, hurtig udvikling, og omfattende karakterisering af morfogenese af Drosophila foster gør det til en model valg for genetiske skærme, hvoraf mange har afdækket grundlæggende udviklingsmæssige veje 3,4. Talrige fænotyper i Drosophila foster er blevet karakteriseret og er let fortolkelige, ofte giver et middel til at identificere de underliggende molekylære genetiske mekanismer, der er ansvarlige for en unormal egenskab.
Historisk set har en mangel af fluen embryo model været vanskeligheden ved at indføre små molekyler til embryonale væv. Denne hindring har stillet begrænsninger: 1) osning kendte bioaktive små molekyler som prober til at afhøre udviklingsmæssige mekanismer og 2) ved hjælp af dette etablerede model til at vurdere teratogene eller farmakologisk aktivitet af ukarakteriserede små molekyler. Som en konsekvens heraf har screening potentiale flueembryo blevet underudnyttet i karakterisering af lille molekyle aktivitet.
Levering af små molekyler til flueembryo kan opnås med to metoder: 1) permeabilisering af æggeskallen og 2) mikroinjektion. Denne artikel præsenterer forskud til metoden for permeabiliseringen, der er nemme at udføre i fastsættelsen af en konventionel Drosophila laboratorium. Det skal bemærkes, at de seneste fremskridt inden mikroinjektion metoder med MicroFluidics teknologi også bidrager til metoder til at indføre forbindelser til embryo 5,6. Introduktion molekyler embryonet forhindres af et voksagtigt lag af æggeskallen 7. Drosophila-æggeskal består af fem lag. Fraindefra og ud, de er: vitellinmembranen, den voksagtige lag, den inderste chorion lag, den endochorion og exochorion 8. De tre ydre chorion lag kan fjernes ved kort emersion af embryoet i fortyndet blegemiddel, der er nævnt et skridt til som dechorionation. Det eksponerede vokslag kan derefter blive kompromitteret ved udsættelse for organiske opløsningsmidler, såsom heptan og octan 7,9, hvilket gør dechorionated embryo gennemtrængelige, mens den forbliver indkapslet i den underliggende vitellinmembranen. Imidlertid er anvendelsen af disse opløsningsmidler indfører komplikationer på grund af deres toksicitet og vanskeligheden i reguleringen af deres stærke permeabilisering indsats, som begge har skarp negative virkninger på levedygtighed embryo 9,10.
En fremgangsmåde til permeabilisering anvendelse af en sammensætning betegnes embryo permeabilisering opløsningsmiddel (EPS) er tidligere blevet beskrevet 1. Dette opløsningsmiddel består af d-limonen og plante-afledte overfladeaktive stoffer, der gør det muligt for opløsningsmiddel for at være miscible med vandige buffere. Den lave toksicitet af d-limonen og evnen til at fortynde opløsningsmidlet ønskede koncentrationer har givet en effektiv metode til at generere permeable embryoner med høj levedygtighed 1. Imidlertid har to endogene faktorer fortsatte med at bringe begrænsninger for anvendelsen. Først embryoner demonstrere heterogenitet i permeabilitet efter EPS behandling, selv når der er sørget for at holde tæt udviklingsmæssige iscenesættelse. For det andet, embryoner ældre end cirka otte timer har vist sig vanskeligt at permeabilisere, i overensstemmelse med en hærdning af æggeskallen, der opstår efter æglægning 11.
Beskrevet her er fremskridt i EPS metode, der: 1) at bistå med at identificere og analysere nær-identisk permeabiliserede embryoner, selv efter fiksering og immunfarvning skridt er blevet henrettet, og 2) gør det muligt permeabilisering af embryoner på sene udviklingsmæssige tidspunkter (> 8 timer, scene 12 og ældre). Specifikt anvendes en langt rødt farvestof,CY5 carboxylsyre, er beskrevet, som tjener som en permeabilitet indikator, som fortsætter i foster under udvikling og efter formaldehyd fiksering. Desuden er det vist, at opdræt embryoner ved 18 ° C fastholder æggeskallen i en EPS følsom tilstand, så permeabilisering af sene embryoner (faser 12-16).
Disse fremskridt overvinde de tidligere nævnte begrænsninger for EPS metodologi. Dette program vil derfor give efterforskerne med et middel til at indføre små molekyler af interesse for embryo på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter samtidig opretholde levedygtighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovennævnte metode skitserer et middel til at opnå levedygtige Drosophila embryoner, der er tilgængelige for små molekyle behandlinger på tværs af en bred udviklingsmæssige område. Denne metode introducerer romanen og enkle konstatering, at aldrende embryoner ved 18 ° C muliggør permeabilisering af embryoer sent med det samme effekt som tidligere set kun i embryoer tidligt. Desuden har anvendelsen af langt rødt farvestof CY5 carboxylsyre som en indikator permeabilitet vist sig effektive i post-l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
