개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Drosophila의 배아는 긴 개발을 제어하는 분자 유전 메커니즘을 해명하기위한 강력한 실험실 모형이다. 이 모델의 유전 조작의 용이성은 다른 동물 모델 및 세포 기반 분석에서 평범 약물 접근 방식을 대신하게했다. 여기에 우리가 개발 초파리 배아에 작은 분자의 응용 프로그램을 사용할 수있는 프로토콜의 최근의 진보에 대해 설명합니다. 이 방법은 태아의 생존 능력을 유지하면서 껍질의 불 투과성을 극복하는 단계를 자세히 설명합니다. 발달 단계의 넓은 범위에 걸쳐 달걀 껍질 permeabilization 용매 이전에 설명 D-리모넨 배아 permeabilization (1 EPS)의 응용 프로그램과 (18 ° C) 이전 치료에 감소 된 온도에서 노화의 배아에 의해 달성된다. 또한, permeabilization 표시로 원적외선 염료 (CY5)의 사용은 표준 빨간색과 녹색 독감을 포함한 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는, 설명라이브 및 고정 준비에 orescent 염료. 이 프로토콜은 발달 메커니즘을 조사뿐만 아니라 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하기위한 연구에하는 생리 활성 화합물을 사용하여 연구에 적용 할 수있다.
서론
Drosophila의 배아 개발 2의 근본적인 메커니즘의 조사를 위해 최고의 모델이되고 있습니다. 이 강력한 모델은 임의의 시점에서 그리고 어떠한 현상 기관 내에 실질적으로 어떤 유전자의 조작을 허용하는 분자 유전 학적 도구의 다양한 배열에 의해지지된다. 초파리 배아의 형태 형성의 작은 크기, 빠른 개발, 다양한 특성은 기본적인 발달 경로에게 3,4를 발견했습니다 많은 것이 유전 스크린에 대한 선택의 모델을 확인합니다. Drosophila의 배아에 많은 표현형이 특징으로 쉽게 해석 할 수 있으며, 종종 비정상적인 특성에 대한 책임을 기본 분자 유전 학적 메커니즘을 식별 할 수있는 수단을 제공하고있다.
역사적으로, 플라이 배아 모델의 단점은 배아 조직에 작은 분자를 도입하는 어려움이있다. 1) 우리 :이 장애물에 대한 제한을 제기했다프로브가 발달 메커니즘을 심문하고 2) 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하는이 설립 모델을 사용하기로 알려진 생리 활성 작은 분자를 주입. 결과적으로, 비행 배아의 스크리닝 전위 저분자 활성의 특성화에 미달되었다.
달걀 껍질의 1) permea....
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프로토콜
1. 플라이 문화, 솔루션 및 배아의 취급 장치의 제조
- 초파리의 가두리를 준비합니다. 10cm 포도 한천 플레이트 효모 붙여 넣기의 자리가 장착 된 인구 케이지에서 원하는 변형 500 + 짝짓기 파리를 놓습니다. 25 ° C의 습도 조절 배양기에서 문화를 유지한다. 주 : 케이지 문화가 일치 배아 누워 패턴을 얻기 위해 에어컨의 하루 이틀이 필요합니다. 효모 붙여 넣기 포도 플레이트를 조절하는 동안 아침에 한 번 저녁에 한 번 변경됩니다.
- EPS를 준비합니다. 37 ° C에서 계면 활성제 (코카 미드 DEA 및 에톡 시화 알콜)의 따뜻한 솔루션 피펫 작은 교반 막대가 구비 된 유리 신틸레이션 바이알에, D-리모넨 18 밀리리터. 피펫 D-리모넨에 1 ㎖의 두 계면 활성제 (각 5 % 최종 농도)의 각. 철저하게 혼합 및 교반 막대를 제거합니다. 주 : EPS의이 원액은 실온에서 약 2 달을 위해 좋다. 솔루션37 ° C 올라가면 완전히 사용하기 전에 계면 활성제를 용해하는 소용돌이해야합니다. 그들은 시간이 지남에 따라 일부의 플라스틱을 용해하므로 EPS 및 D-리모넨은 유리 용기에 저장되어야한다.
- 배아 dechorionation 솔루션, 배양 매체, 염료 및 약물 솔루션을 준비합니다. 25 ....
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결과
배아의 처리 장치는 위의 프로토콜에있는 조작에 대해 "집에서 만든"장치를 시각화 지원하기 위해 그림 1에 있습니다. 그림 2에 보이는 결과 개발 후반 단계에서 EPS로 permeabilized하는 능력에 18 ° C에서 배아를 양육의 강력한 효과를 보여줍니다. 이 조건은 프로토콜 2.1 단계에 적용된다. 일반적으로 EPS 처리 배아에서 볼 투과성의 다양한 수준을 나타 내기 위해 CY5 카르 복실 산 염료의 효과는 그림 3에서 볼 수있다. 노른자에 염료 분포의 발달 역학도 생존 능력을 평가하는 데 사용되는 기준을 공개, 그림 3에서 볼 수있다 , 프로토콜에 설명 된대로 4.2 단계. 독소 처리, 포름 알데히드 고정 및 면역 염색에 후속 배아 permeabilization을 결정 CY5 염료 유틸리티는도 4의 결과에 의해 도시된다.
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토론
위의 방법은 다양한 개발 범위에 걸쳐 작은 분자 치료에 접근 가능한 Drosophila의 배아를 획득 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 이전에는 초기 단계의 배아에서와 같이 18 ° C에서 배아를 노화 동일한 효능과 최종 단계의 배아의 permeabilization을 가능하게하는 소설과 간단한 발견을 소개합니다. 또, 투과 표시와 같은 원적외선 염료 CY5 카르 복실 산의 사용은 포스트 픽스 애플리케이션에 효과 입증 발달 표현형을 나타 내기 위해 사용할 수있는 종래의 적색 및 녹색 형광 표식을 방해하지 않는다. 이러한 연구 결과는 크게 EPS 방법의 효능과 유틸리티를 진행.
이 방법은 생활과 고정 된 배아의 준비를 모두 분석에 대한 의무입니다. 시야 현미경 및 설정 슬라이드 챔버를 사용하여 배아 발달의 전반에 득점 전형적인 특징은 형태 발생의 움직임이다 등배반 엽, 두부 고랑 형성, germband 신장 및 germband 후퇴 1 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH/NIEHS R03ES021581(M.D.R.에 수여) 및 University of Rochester Environmental Health Center(NIH/NIEHS P30 ES001247)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플라이 케이지 | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| 코카미드 DEA [니놀 11-CM] | Stepan Chemical | 특별 주문 요청 | http://www.stepan.com/ |
| 에톡실화 알코올 [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | 은 특별 주문 | 요청 http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (초고순도 등급) | Florida Chemical Co. | 특별 주문 요청 | http://www.floridachemical.com/ |
| 차아염소산나트륨 | 피셔 | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| 트윈-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS 분말 | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | |
| http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| 방패와 Sang M3 미디엄 | 시그마 | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex 나일론 메쉬 | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| 용존 산소(DO) 멤브레인 | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm 원형 no.1 커버 슬립 | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| 포도-아가르 플레이트 믹스 | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| 너트 레이터 | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
참고문헌
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Gene....
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재인쇄 및 허가
