Ein Verfahren zur Permeabilisierung der<em> Drosophila</em> Embryonen für Tests von Small Molecule Aktivität
Summary
Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell.
Abstract
Die Drosophila-Embryo ist seit langem ein leistungsfähiges Labormodell für die Aufklärung der molekularen und genetischen Mechanismen, welche die Entwicklung steuern. Die Einfachheit der genetischen Manipulationen mit diesem Modell pharmakologische Ansätze, die in anderen Tiermodellen und Tests auf Zellbasis alltäglich sind verdrängt. Hier beschreiben wir die jüngsten Fortschritte in einem Protokoll, Anwendung von kleinen Molekülen ermöglicht, den Entwicklungsfruchtfliegenembryo. Das Verfahren vor, um die Details Dichtigkeit der Eierschale zu überwinden und gleichzeitig Embryo Lebensfähigkeit. Eierschale Permeabilisierung in einem breiten Spektrum von Entwicklungsstufen wird durch Anwendung eines zuvor beschriebenen d-Limonen Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS 1) und durch Alterung Embryonen bei reduzierter Temperatur (18 ° C) vor der Behandlung erreicht. Darüber hinaus ist die Verwendung eines fernen Rot-Farbstoff (CY5) als Permeabilisierung Indikator beschrieben, die mit stromabwärts Verwendung von handelsüblichen roten und grünen Grippe kompatibel istorescent Farbstoffe in lebenden und fixierten Präparaten. Dieses Protokoll ist auf Studien mit bioaktiven Verbindungen zu Entwicklungsmechanismen für ein Studium an der Bewertung teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized richtet Sonde als auch.
Introduction
Die Drosophila-Embryo weiterhin ein erstklassiges Modell für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entwicklung 2 sein. Dieses leistungsstarke Modell wird durch eine breite Palette von molekulargenetischen Werkzeugen, die Manipulationen der wesentlichen jedem Gen zu jedem Zeitpunkt und in jeder sich entwickelnden Organ erlauben unterstützt. Die geringe Größe, die schnelle Entwicklung und umfangreiche Charakterisierung der Morphogenese des Drosophila-Embryos machen es zu einem Modell der Wahl für genetische Bildschirme, von denen viele grundlegende Entwicklungswege aufgedeckt 3,4. Zahlreiche Phänotypen in Drosophila-Embryos wurden aus und sind leicht zu interpretieren, die oft ein Mittel, um die molekularen genetischen Mechanismen, die eine abnorme Merkmal verantwortlich zu identifizieren.
Historisch gesehen, ein Mangel des Fliegenembryo Modell war die Schwierigkeit der Einführung kleine Moleküle zu embryonalen Geweben. 1) uns: Dieses Hindernis hat Beschränkungen gestelltten bekannten bioaktiven kleinen Molekülen als Sonden zur Entwicklungsmechanismen zu verhören und 2) mit diesem etablierten Modell teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized beurteilen. Als Folge hat das Screening Potential des Fliegenembryo in Charakterisierung von Kleinmolekül-Aktivität nicht ausgelastet ist.
1) Permeabilisierung der Eierschale und 2) Mikroinjektion: Abgabe kleiner Moleküle Fliegenembryo kann mit zwei Methoden erreicht werden. Dieser Artikel stellt Fortschritte der Methode der Permeabilisierung, die einfach in der Einstellung eines herkömmlichen Drosophila Labor auszuführen sind. Es sei darauf hingewiesen, dass die jüngsten Fortschritte in der Mikroinjektionsverfahren mit Mikrofluidik-Technologie trägt auch auf Verfahren zum Einführen von Verbindungen in den Embryo 5,6 ist. Einführen von Molekülen in den Embryo durch eine Wachsschicht von der Eierschale 7 verhindert. Die Drosophila Eierschale besteht aus fünf Schichten. Ausdie von innen nach außen sind sie: die Dotterhaut, die wachsartige Schicht, die innere Chorion-Schicht, der endochorion und die exochorion 8. Die drei Außen Chorion-Schichten können durch kurze Auftauchen des Embryos in verdünnter Bleichmittel entfernt werden, so wird ein Schritt, um so dechorionation. Die freiliegende Wachsschicht kann dann durch Exposition gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Heptan und Octan 7,9, wodurch die dechorionated Embryo lässigen beeinträchtigt werden, während es noch in der zugrunde liegenden Dottermembran umhüllt. , Verwendung dieser Lösungsmittel führt jedoch Komplikationen aufgrund ihrer Toxizität und der Schwierigkeit bei der Regulierung ihrer starken permeabilisierend Aktion, die beide stark negativen Effekte auf den Embryo Lebensfähigkeit 9,10.
Ein Verfahren zur Permeabilisierung unter Verwendung einer Zusammensetzung bezeichnet Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS) wurde bereits beschrieben 1 gewesen. Diese Lösungsmittel aus d-Limonen und von Pflanzen abgeleitete Tenside, die Lösungsmittel ermöglichen miscibl seine mit wässrigen Puffern. Die niedrige Toxizität von d-Limonen und die Fähigkeit des Lösungsmittels auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen ist eine wirksame Methode zur lässigen Embryonen mit hoher Lebensfähigkeit 1 erzeugen ergab. Jedoch sind zwei endogene Faktoren weiterhin Beschränkungen hinsichtlich der Anwendung zu bringen. Zunächst Embryonen zeigen Heterogenität der Durchlässigkeit nach EPS-Behandlung, auch wenn darauf geachtet wird, schließen Entwicklungs Inszenierung halten. Zweitens Embryonen älter als etwa acht Stunden haben schwer zu permeabilisieren, im Einklang mit einer Verhärtung der Eierschale, die nach der Eiablage 11 tritt bewährt.
Hier beschrieben werden, sind Fortschritte in der EPS-Verfahren, dass: 1) bei der Identifizierung und Analyse von nahezu identisch permeabilisiert Embryonen, auch nach Fixierung und Immunfärbung Schritte ausgeführt worden sind und 2) zu ermöglichen Permeabilisierung der Embryonen im späten Entwicklungszeitpunkten (> 8 h, Bühne 12 und älter). Insbesondere Anwendung eines dunkelroten Farbstoff,CY5 Carbonsäure, beschrieben, die als Durchlässigkeit Anzeige, die während der Entwicklung und nach Formaldehydfixierung im Embryo weiterhin dient. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Aufzucht Embryonen bei 18 ° C hält die Eierschale in eine EPS-sensitiven Zustand, so dass Permeabilisierung der späten Phase Embryonen (Stufen 12-16).
Diese Fortschritte zu überwinden, die zuvor erwähnten Einschränkungen für die EPS-Methodik. Diese Anwendung wird daher stellen die Ermittler mit einem Mittel, um kleine Moleküle von Interesse für den Embryo in unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten einführen und gleichzeitig Rentabilität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Verfahren beschreibt ein Mittel, um den Erhalt lebensfähiger Drosophila-Embryonen, die zugänglich zu kleines Molekül Behandlungen in einem breiten Entwicklungsbereich sind. Diese Methode stellt die neue und einfache Feststellung, dass das Altern Embryonen bei 18 ° C ermöglicht Permeabilisierung der späten Phase Embryonen mit der gleichen Wirksamkeit wie zuvor nur in frühen Embryonen gesehen. Darüber hinaus hat die Verwendung von fernen Rot Cy5 Carbonsäure als Indikator wirksamen P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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