के Permeabilization की एक विधि<em> ड्रोसोफिला</emलघु अणु गतिविधि का Assays के लिए> भ्रूण
Summary
विकासशील ड्रोसोफिला भ्रूण को छोटे अणुओं का परिचय उपन्यास यौगिकों, दवाओं, और विषाक्त पदार्थों के जैविक गतिविधि निस्र्पक के साथ ही मौलिक विकास के रास्ते की जांच के लिए के लिए महान क्षमता प्रदान करता है. वर्णित विधियों के साथ साथ ड्रोसोफिला भ्रूण मॉडल की उपयोगिता का विस्तार, इस दृष्टिकोण को प्राकृतिक बाधाओं पर काबू पाने कि कदम रूपरेखा.
Abstract
ड्रोसोफिला भ्रूण लंबे विकास को नियंत्रित कि आणविक और आनुवंशिक तंत्र elucidating के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगशाला मॉडल की गई है. इस मॉडल के साथ आनुवंशिक जोड़तोड़ की आसानी अन्य पशु मॉडल और सेल आधारित assays में आम हैं कि औषधीय दृष्टिकोण supplanted किया है. यहाँ हम विकासशील फल मक्खी भ्रूण को छोटे अणुओं के आवेदन सक्षम बनाता है एक प्रोटोकॉल में हाल के अग्रिमों का वर्णन. विधि भ्रूण व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए eggshell के अछिद्रता पर काबू पाने के लिए कदम विवरण देता है. विकास के चरणों की एक विस्तृत रेंज में eggshell permeabilization विलायक एक पहले से वर्णित लाइमोनीन भ्रूण permeabilization (1 ईपीएस) के आवेदन के द्वारा और (18 डिग्री सेल्सियस) पहले उपचार के लिए कम तापमान पर उम्र बढ़ने के भ्रूण से प्राप्त किया जाता है. इसके अलावा, एक permeabilization सूचक के रूप में एक दूर की लाल डाई (Cy5) के उपयोग के मानक लाल और हरे रंग फ्लू से जुड़े बहाव के अनुप्रयोगों के साथ संगत है, जो वर्णन किया गया हैलाइव और तय तैयारी में orescent रंजक. इस प्रोटोकॉल विकास तंत्र की जांच के साथ ही uncharacterized छोटे अणुओं की टेराटोजेनिक या pharmacologic गतिविधि का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से पढ़ाई के लिए करने के लिए bioactive यौगिकों का उपयोग अध्ययन के लिए लागू है.
Introduction
ड्रोसोफिला भ्रूण विकास 2 के बुनियादी तंत्र की जांच के लिए एक प्रमुख मॉडल होना जारी है. इस शक्तिशाली मॉडल किसी भी समय बिंदु पर है और किसी भी विकासशील अंग के भीतर अनिवार्य रूप से किसी भी जीन की जोड़तोड़ की अनुमति है कि आणविक आनुवंशिक उपकरणों की एक विस्तृत सरणी के द्वारा समर्थित है. ड्रोसोफिला भ्रूण की morphogenesis के छोटे आकार के तेजी से विकास और व्यापक लक्षण वर्णन यह मौलिक विकास के रास्ते 3,4 पर्दाफाश किया है, जिनमें से कई आनुवंशिक स्क्रीन, के लिए पसंद की एक मॉडल बनाने के. ड्रोसोफिला भ्रूण में कई phenotypes विशेषता है और आसानी से व्याख्या कर रहे हैं, अक्सर एक असामान्य विशेषता के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित आणविक आनुवंशिक तंत्र की पहचान करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने के लिए किया गया है.
ऐतिहासिक, मक्खी भ्रूण मॉडल की एक कमी भ्रूण के ऊतकों के लिए छोटे अणुओं को शुरू की कठिनाई दिया गया है. 1) हमें: इस बाधा पर सीमाओं के समक्ष रखी हैजांच विकास तंत्र से पूछताछ और 2) uncharacterized छोटे अणुओं की टेराटोजेनिक या pharmacologic गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस स्थापित मॉडल का उपयोग करने के रूप में जाना जाता है bioactive छोटे अणुओं आईएनजी. एक परिणाम के रूप में, मक्खी भ्रूण की स्क्रीनिंग संभावित छोटे अणु गतिविधि के लक्षण वर्णन में underutilized किया गया है.
Eggshell का 1) permeabilization और 2) microinjection: मक्खी भ्रूण को छोटे अणुओं की डिलिवरी दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है. यह लेख एक पारंपरिक ड्रोसोफिला प्रयोगशाला की स्थापना में निष्पादित करने के लिए आसान कर रहे हैं कि permeabilization की विधि को अग्रिम प्रस्तुत करता है. यह microfluidics तकनीक के साथ microinjection तरीकों में हाल के अग्रिमों भी भ्रूण 5,6 यौगिकों शुरू करने के तरीकों के लिए योगदान दे रहा है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. भ्रूण को अणुओं को शुरू eggshell 7 के एक मोमी परत से रोका है. ड्रोसोफिला खोल पांच परतों के होते हैं. सेअंदर बाहर वे हैं: पीतक झिल्ली, मोमी परत, भीतरी कोरियोनिक परत, endochorion और exochorion 8. तीन बाहरी कोरियोनिक परतों पतला ब्लीच में भ्रूण की संक्षिप्त प्रकट होना द्वारा हटाया जा सकता है, एक कदम dechorionation के रूप में भेजा. यह अंतर्निहित पीतक झिल्ली में encased रहता है, जबकि उजागर मोमी परत तब, dechorionated भ्रूण पारगम्य प्रतिपादन ऐसे हेपटैन और ओकटाइन 7,9 के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स,, के लिए जोखिम से समझौता किया जा सकता है. हालांकि, इन विलायकों का उपयोग उनकी विषाक्तता और भ्रूण व्यवहार्यता 9,10 पर पूर्ण रूप से नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जो दोनों के अपने मजबूत permeabilizing कार्रवाई, विनियमित करने में कठिनाई के कारण जटिलताओं का परिचय.
विलायक एक रचना में कहा भ्रूण permeabilization (ईपीएस) का उपयोग permeabilization की पद्धति पहले से 1 वर्णित किया गया है. इस विलायक miscibl होने के लिए विलायक कि सक्षम लाइमोनीन और संयंत्र व्युत्पन्न surfactants के होते हैंजलीय बफ़र्स के साथ ई. लाइमोनीन और वांछित सांद्रता के लिए विलायक पतला करने की क्षमता का कम विषाक्तता उच्च व्यवहार्यता 1 के साथ पारगम्य भ्रूण उत्पन्न करने के लिए एक प्रभावी तरीका सामने आए है. हालांकि, दो अंतर्जात कारकों आवेदन करने के लिए सीमाओं को लाने के लिए जारी किया है. सबसे पहले, भ्रूण देखभाल करीब विकासात्मक मचान बनाए रखने के लिए लिया जाता है, तब भी जब ईपीएस उपचार के बाद पारगम्यता में विविधता प्रदर्शित करता है. दूसरा, लगभग आठ घंटे से अधिक पुराने अंडे 11 बिछाने के बाद होता है कि eggshell के एक सख्त साथ संगत, permeabilize करने के लिए मुश्किल साबित हो रहा है भ्रूण.
यहाँ वर्णित ईपीएस विधि के क्षेत्र में प्रगति कर रहे हैं कि: 1) निर्धारण और immunostaining चरणों निष्पादित और 2)> (देर से विकास के समय बिंदुओं पर 8 घंटा, चरण भ्रूण की permeabilization सक्षम किया गया है, के बाद भी लगभग हूबहू permeabilized भ्रूण की पहचान और विश्लेषण में सहायता 12 और पुराने). विशेष रूप से, एक दूर की लाल रंग के आवेदन,Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड, विकास के दौरान और formaldehyde निर्धारण के बाद भ्रूण में बनी रहती है, जो एक पारगम्यता सूचक के रूप में कार्य करता है वर्णन किया गया है. इसके अलावा, यह 18 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण पालन देर चरण भ्रूण (चरणों 12-16) के permeabilization सक्षम करने, एक ईपीएस संवेदनशील राज्य में eggshell का कहना है कि दिखाया गया है.
इन अग्रिमों ईपीएस कार्यप्रणाली को पहले उल्लेख सीमाओं को पार. यह आवेदन इसलिए व्यवहार्यता बनाए रखते हुए अलग विकासात्मक समय बिंदुओं पर भ्रूण के हित के लिए छोटे अणुओं को पेश करने के लिए एक साधन के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करेगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त विधि एक व्यापक विकास रेंज भर में छोटे अणु उपचार के लिए पहुंच रहे हैं कि व्यवहार्य भ्रूण ड्रोसोफिला प्राप्त करने के लिए एक साधन की रूपरेखा. इस पद्धति पहले से ही प्रारंभिक चरण भ्रूण में देखा क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
