Ett förfarande för Permeabilization av<em> Drosophila</em> Embryon för analyser av Small Molecule aktivitet

Summary

Införande av små molekyler till utvecklings Drosophila embryot erbjuder stora möjligheter för karakterisering av biologisk aktivitet av nya föreningar, läkemedel och gifter liksom för sondering grundläggande utvecklingsvägar. Metoder beskrivs häri beskriva åtgärder som övervinner naturliga hinder för detta tillvägagångssätt, utöka nyttan av Drosophila embryon modellen.

Abstract

Drosophila embryot har länge varit en kraftfull laboratoriemodell för att belysa molekylära och genetiska mekanismer som styr utvecklingen. Den enkla genetiska manipulationer med denna modell har ersatt farmakologiska metoder som är vanliga i andra djurmodeller och cell-baserade analyser. Här beskriver vi de senaste framstegen inom ett protokoll som möjliggör tillämpning av små molekyler till utvecklingsfruktflugor embryo. Metoden information steg för att övervinna den ogenomtränglighet av äggskal medan embryoviability upprätthållande. Äggskal permeabilisering över ett brett spektrum av utvecklingsstadier uppnås genom tillämpning av en tidigare beskriven d-limonen embryo permeabilization lösningsmedel (EPS ¹⁾ och genom åldrande embryon vid reducerad temperatur (18 ° C) innan behandlingar. Dessutom är användning av ett långt rött färgämne (CY5) som en permeabilization indikator beskrivs, som är kompatibel med tillämpningar nedströms involverar standard röd och grön influensaorescent färgämnen i levande och fasta beredningar. Detta protokoll är tillämpligt på studier med bioaktiva föreningar att söka utvecklingsmekanismer samt för studier som syftar till att utvärdera teratogen eller farmakologisk aktivitet av okarakteriserade små molekyler.

Introduction

Drosophila embryot fortsätter att vara en ledande modell för undersökning av grundläggande mekanismer för utveckling ^2. Denna kraftfulla modellen stöds av ett brett spektrum av molekylära genetiska verktyg som tillåter manipulationer av i huvudsak vilken gen som helst punkt och inom alla utvecklings organ. Den lilla storleken, snabb utveckling, och omfattande karakterisering av morfogenes av Drosophila embryon gör det en modell av val för genetiska skärmar, varav många har upptäckt grundläggande utvecklingsbanor ^3,4. Många fenotyper i Drosophila embryot har karakteriserats och är lätt tolkningsbara, ofta ger ett medel för att identifiera bakomliggande molekylära genetiska mekanismer som är ansvariga för en onormal egenskap.

Historiskt sett har en brist av flugan embryot modellen varit svårigheten att införa små molekyler till embryonala vävnader. Detta hinder har ställt begränsningar: 1) ossning kända bioaktiva små molekyler som sönder för att förhöra utvecklingsmekanismer och 2) med hjälp av denna etablerade modell för att utvärdera teratogena eller farmakologisk aktivitet av okarakteriserade små molekyler. Som en följd av detta har screening potential flugan embryot varit underutnyttjade i karakterisering av små molekyler aktivitet.

Leverans av små molekyler till flyga embryot kan åstadkommas med två metoder: 1) permeabilisering av äggskalet och 2) mikroinjektion. I denna artikel presenteras förskott till metoden för permeabilization som är lätta att utföra i inställningen av en konventionell Drosophila laboratorium. Det bör noteras att den senaste tidens framsteg inom mikroinjektion metoder med mikrofluidik teknik bidrar också till metoder för att införa föreningarna till embryot ^5,6. Introduktion av molekyler till embryot förhindras av ett vaxartat skikt av äggskalet ^7. Drosophila äggskal består av fem skikt. Fråninifrån och ut är de: vitellinmembranet, det vaxartade skiktet, det inre chorionic skiktet, endochorion och exochorion ^8. De tre yttre chorionic skikt kan avlägsnas genom kortvarig emersion av embryot i utspädd blekmedel, avses ett steg till så dechorionation. Den exponerade vaxartat skikt kan sedan äventyras genom exponering för organiska lösningsmedel, såsom heptan och oktan ^7,9, rendering dechorionated embryo genomsläpplig, medan det fortfarande är innesluten i den underliggande vitellinmembranet. Men användningen av dessa lösningsmedel introducerar komplikationer på grund av deras giftighet och svårigheten att reglera sina starka permeabilisering handling, som båda har skarp negativa effekter på embryo bärkraft ^9,10.

Förfarande för permeabilisering med användning av en komposition benämnd embryo permeabilization lösningsmedel (EPS) har tidigare beskrivits ^1. Detta lösningsmedel består av d-limonen och växt-härledda ytaktiva ämnen som gör att det lösningsmedel som skall miscible med vattenbaserade buffertar. Den låga toxiciteten av d-limonen och förmåga att späda ut lösningsmedlet för att önskade koncentrationer som gav en effektiv metod för att generera permeabla embryon med hög viabilitet ^1. Däremot har två endogena faktorer fortsatte att föra begränsningar till ansökan. Först, embryon visar heterogenitet i permeabilitet efter EPS behandling, även om försiktighet vidtas för att upprätthålla ett nära utvecklings iscensättning. För det andra, embryon äldre än cirka åtta timmar har visat sig svårt att permeabilize, i linje med en härdning av äggskal som inträffar efter äggläggningen ^11.

Beskrivs här är framsteg i EPS-metoden som: 1) hjälpa till att identifiera och analysera nästan identiskt permeabilized embryon, även efter fixering och immunfärgning åtgärder har verkställts och 2) möjliggöra permeabilisering av embryon vid sena utvecklings tidpunkter (> 8 tim, scen 12 och äldre). Närmare bestämt applicering av ett långt rött färgämne,CY5 karboxylsyra, beskrivs som fungerar som en permeabilitet indikator, som kvarstår i embryot under utveckling och efter formaldehydfixering. Dessutom visas att uppfödning av embryon vid 18 ° C upprätthåller äggskal i en EPS känsligt tillstånd, som möjliggör permeabilisering av sena skede embryon (stadier 12-16).

Dessa framsteg övervinna de tidigare nämnda begränsningarna för EPS-metodik. Det här programmet kommer därför att ge utredarna med ett medel för att införa små molekyler av intresse för embryot vid tydliga utvecklings tidpunkter med bibehållen lönsamhet.

Protocol

1. Beredning av Fly kulturer, Lösningar och Embryo Handling Devices Bered en bur kultur av Drosophila. Placera 500 + parning flugor av den önskade stammen i en population bur försedd med en 10 cm druva-agarplatta och en fläck av jäst pasta. Upprätthålla kultur i en 25 ° C luftfuktighet kontrollerad inkubator. OBS!   Cage kulturer kräver en dag eller två av konditionering för att få konsekventa embryo om mönster. Grape plattor med jäst pasta byts en gång på morgonen och e…

Representative Results

Embryo hanteringsanordningar är avbildade i figur 1 för att hjälpa till att visualisera de "hemgjorda" anordningar för manipulation i ovan nämnda protokoll. Resultaten ses i figur 2 illustrerar robusta effekten av uppfödning embryon vid 18 ° C på deras förmåga att permeabiliseras av EPS i sen utvecklingsfas. Detta villkor tillämpas i protokollet steg 2.1. Effektivitet av Cy5 karboxylsyra färgämne för att avslöja de olika nivåerna av genomtränglighet typiskt se…

Discussion

Metoden ovan beskriver ett sätt att få livskraftiga Drosophila embryon som är tillgängliga för små molekyler behandlingar över ett brett utvecklings sortiment. Denna metod introducerar nya och enkla konstaterande att åldras embryon vid 18 ° C möjliggör permeabilisering av embryon sent skede med samma effekt som tidigare bara sett i embryon tidigt stadium. Dessutom har användningen av långt röda färgämnet CY5 karboxylsyra som en permeabilitet indikator visat sig effektiv i post-sätta fast och in…

Materials

Fly Cage	Flystuff.com	59-101	http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
d-limonene (Ultra high purity grade)	Florida Chemical Co.	call for special order	http://www.floridachemical.com/
Sodium hypochlorite	Fisher	SS290-4	http://www.fishersci.com/
Tween-20	Fisher	BP337	http://www.fishersci.com/
PBS powder	Sigma	56064C	http://www.sigmaaldrich.com/
Rhodamine B	Sigma	R6626	http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 carboxylic acid	Lumiprobe	#23090	http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO	Sigma	472310-100	http://www.sigmaaldrich.com/
Shields and Sang M3 medium	Sigma	S8398	http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh	Flystuff.com	57-102	http://flystuff.com/misc.php
Dissolved oxygen (DO) membrane	YSI	#5793	http://www.ysireagents.com/search.php
25mm circular no.1 cover slip	VWR	48380-080	https://us.vwr.com/
Grape-agar plate mix	Flystuff.com	47-102	http://flystuff.com/media.php
Nutator	VWR	82007-202	https://us.vwr.com/