Un<em> Ex vivo</em> Système de culture à étudier la thyroïde développement
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
La thyroïde est une glande endocrine bilobated localisée à la base du cou, la production des hormones thyroïdiennes T3, T4, et la calcitonine. T3 et T4 sont produites par des thyrocytes différenciés, organisés en sphères fermées appelées follicules, tandis que la calcitonine est synthétisée par les cellules C, intercalés entre les follicules et un réseau dense de capillaires sanguins. Bien que l'architecture et les fonctions de la thyroïde adultes ont été abondamment décrits et étudiés, la formation des unités de "angio-folliculaires", la répartition des cellules C dans le parenchyme et les communications paracrines entre les cellules epitheliales et endotheliales est loin d'être compris.
Cette méthode décrit les étapes successives de la souris thyroïde embryonnaire ébauches dissection et de sa culture sur des filtres semi-poreuses ou sur des lames de microscopie en plastique. Dans un délai de quatre jours de ce système de culture récapitule fidèlement dans le développement de la thyroïde vivo. En effet, (i) milliardsobation de l'organe se produit (pour les explants de E12.5), (ii) les précurseurs thyrocytes organiser dans les follicules et polarisent, (iii) thyrocytes et C-cellules se différencient, et (iv) les cellules endothéliales présentes dans le tissu microdisséquée prolifèrent, migrent dans l' lobes de la glande thyroïde, et associer étroitement avec les cellules épithéliales, comme ils le font in vivo.
tissus de la thyroïde peuvent être obtenus auprès de type sauvage, KO ou embryons transgéniques fluorescents. En outre, des explants de la culture peut être manipulé par l'addition d'inhibiteurs, des anticorps bloquants, des facteurs de croissance, ou même des cellules ou du milieu conditionné. Développement ex vivo peut être analysée en temps réel, ou à n'importe quel moment de la culture par immunocoloration et RT-qPCR.
En conclusion, la culture de la thyroïde des explants combiné avec l'aval l'ensemble du montage ou sur des sections d'imagerie et de profil d'expression génique offre un système puissant pour manipuler et étudier morphogénétiques et de différenciation des événements de la thyroïde organogenesis.
Introduction
La glande thyroïde est une collection de sphères épithéliales indépendants, appelés follicules, entouré par un réseau dense de capillaires endothéliales. Cette organisation permet la fonction thyroïdienne: capillaires endothéliales fournissent thyrocytes avec de l'iode, nécessaires à la synthèse des hormones T3 et T4, et de distribuer ces derniers à l'ensemble du corps. Dispersés entre les follicules capillaires et, C-cellules produisent l'hormone calcitonine hypocalcémique 1. Bien que l'architecture et les fonctions de la thyroïde adulte sont bien connus, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement embryonnaire de la thyroïde (formation du follicule et la différenciation) sont loin d'être compris.
Au cours de l'embryogenèse, les thyrocytes progéniteur origine comme un épaississement (l'ébauche de la ligne médiane) de la paroi ventrale de l'endoderme de l'intestin antérieur au jour embryonnaire (e) de 8,5 dans l'embryon de souris, tandis que les cellules C progéniteurs sont créés à E11.5 sous forme de saillies en forme de goutte d'eau ( le bo ultimobranchialematrices) de la quatrième poches pharyngées 2-6. Le bourgeon de la ligne médiane se détache alors de l'endoderme, élargit bilatéral de fusionner à E13.5 avec les organismes ultimobranchiaux de chaque côté de la trachée. Enfin, thyrocytes organisent dans les follicules et C-cellules se différencient.
Les connaissances actuelles sur la formation de la thyroïde provient principalement de l'analyse histologique des tissus fixés, mais les événements morphogénétiques impliqués dans la formation de la thyroïde sont très dynamique et impliquer les communications et les interactions entre les différents types de cellules et avec la matrice extracellulaire. Des travaux récents ont montré que les progéniteurs de thyrocyte produisent des niveaux élevés de VEGF pour recruter des cellules endothéliales de la thyroïde en développement, et, à son tour, recrutent les cellules endothéliales favorisent la formation de follicules et de la différenciation des cellules C 7.
La plupart des études ex vivo sur la thyroïde ont été effectués sur des cellules de la thyroïde dérivé adultes isolés, cultivés soit sur culture de tissus 2D plastique dparoisses ou dans des matrices 3D. L'utilisation de ces types de cultures, les cellules folliculaires différenciées soit rester polarisé et organisées en follicules ou réacquérir une organisation 3D 8-10. Cependant, ces cellules épithéliales purs, explantées à partir de leur environnement physiologique, et cultivées en 2D, ne tiennent pas compte des interactions avec la matrice extracellulaire, les cytokines, les facteurs de croissance et d'autres types cellulaires tels que les cellules endotheliales ou les nerfs qu'ils rencontrent normalement in vivo. Une étude très agréable a récemment décrit un protocole de différenciation des cellules ES en utilisant des follicules thyroïdiens une étape finale de la culture en 3D matrigel 11. Cependant, ces cultures 3D manquent de contact avec d'autres types cellulaires.
Sur la base de l'expertise précédente sur le pancréas et les glandes salivaires culture d'organes 12 à 14, un procédé pour la dissection de souris embryonnaire thyroïde anlagen et mise en culture des explants sur les filtres semi-poreuses ou sur des lames de microscope en plastique a été développé.
Quandtravailler avec des embryons E12.5, la double origine de la anlagen de la thyroïde (ébauche de la ligne médiane et les deux organes latéraux ultimobranchiaux) a imposé la microdissection d'un grand fragment de tissu. Celui-ci contenait la trachée, mais pas l'œsophage, et s'étendait des artères du pharynx arc jusqu'à l'enflure aryténoïde. Lorsqu'elle est cultivée sur les filtres, l'ébauche de la ligne médiane s'étend latéralement de chaque côté de la trachée, où ils fusionnent avec les organes ultimobranchiaux pour former les deux lobes de la glande thyroïde, toujours reliés par un isthme.
En culture, les cellules épithéliales prolifèrent, organisent dans les follicules et se différencient en thyrocytes et les cellules C, en fonction de leur origine. Les cellules endothéliales contenues dans le tissu microdisséquée prolifèrent et envahissent les lobes de la glande thyroïde pour enfin associer étroitement à la structure épithéliale folliculaire, indépendamment de la circulation sanguine ou des facteurs circulants également. Comme le développement des explants récapitule fidèlement in vivo développerment, ce système de culture est optimale pour étudier les événements morphogénétiques et de différenciation qui se produisent au cours du développement de la glande thyroïde.
tissus de la thyroïde peuvent être obtenus auprès de type sauvage, KO ou embryons transgéniques fluorescents, et le système de culture est prête à perte et expériences de gain de fonction. Enfin, imagerie time-lapse d'explants de la thyroïde marqués par fluorescence sur des plats en plastique de microscopie pourrait être exploitée afin de mieux étudier la cinétique et la continuité des mouvements morphogénétiques qui se produisent in vivo. Imagerie time-lapse a déjà été utilisée pour étudier la morphogenèse de ramification du pancréas 15,16 ou le bourgeon urétéral 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce document décrit une méthode pour disséquer et de culture des explants de la thyroïde (E12.5) ou lobes (E14.5) afin d'étudier et de mieux comprendre les événements complexes conduisant à la formation de la thyroïde. En raison de la double origine de la ébauches de la thyroïde (le bourgeon de la ligne médiane et les deux corps ultimo-latérales), et leur petite taille, un fragment de tissu de E12.5 rostrale localisée aux artères du pharynx arc, et contenant la trachée, mais pas l'œsophage est mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
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