En<em> Ex vivo</em> Kultur system for å studere Thyroid Development

Summary

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Abstract

Den skjoldbrusk er en bilobated endokrin kjertel lokalisert på bunnen av nakken, som produserer skjoldbrusk hormoner T3, T4, og kalsitonin. T3 og T4 er produsert av differensierte thyrocytes, organisert i lukkede områder som kalles follikler, mens calcitonin er syntetisert av C-celler, ispedd i mellom folliklene og et tett nettverk av blodkapillærer. Selv om voksen thyroid arkitektur og funksjoner har blitt omfattende beskrevet og undersøkt, er dannelsen av "angio-follikulære"-enheter, fordelingen av C-celler i parenchyma og parakrine kommunikasjon mellom epiteliale og endoteliale celler langt fra å bli forstått.

Denne metoden beskriver sekvensielle trinn av mus embryonale thyroid anlagen disseksjon og sin kultur på halvporøst filtre eller på mikros plast lysbilder. I løpet av en periode på fire dager, trofast sammenfatter dette kultursystem in vivo thyroid utvikling. Faktisk, (i) milliobation av organet skjer (for E12.5 eksplantater), (ii) thyrocytes forløpere organisere i folliklene og polariserer, (iii) thyrocytes og C-cellene differensieres, og (iv) endotel-cellene som er tilstede i microdissected vev spre seg, vandrer inn i thyroid fliker og tett forbinder med epitelceller, slik de gjør in vivo.

Skjoldbrusk vev kan fås fra villtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoer. Videre eksplantater kultur kan bli manipulert ved tilsetning av inhibitorer som blokkerer antistoffer, vekstfaktorer, eller til celler eller kondisjonerte medium. Ex vivo utvikling kan bli analysert i sanntid, eller når som helst av kulturen ved farging og RT-qPCR.

I konklusjonen, skjoldbrusk eksplantering kultur kombinert med nedstrøms hel-mount eller på strekninger bildebehandling og genuttrykk profilering gir et kraftig system for å manipulere og studere morphogenetic og differensiering hendelsene i skjoldbrusk organogenesis.

Introduction

Skjoldbruskkjertelen er en samling av uavhengige epitel sfærer, kalt follikler, omgitt av et tett nettverk av endothelial kapillærer. Denne organisasjonen lar thyroideafunksjonen: endothelial kapillærer gi thyrocytes med jod, som kreves for T3 og T4 hormon syntese, og distribuere disse sistnevnte til hele kroppen. Spredt i mellom folliklene og kapillærer, C-celler produsere hypocalcemic hormonet calcitonin ^en. Selv om voksen thyroid arkitektur og funksjoner er godt kjent, de cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i skjoldbruskembryoutvikling (hårsekken dannelse og differensiering) er langt fra å bli forstått.

Under embryogenesen thyrocytes stamfar stammer som en fortykkelse (midtlinjen anlage) av ventral veggen av forutgående endoderm på embryonale dag (e) 8,5 i musen embryo, mens C-celler forfedre stammer på e11.5 som dråpeformede utvekster ( den ultimobranchial bodør) av fjerde svelget poser ^2-6. Den midtlinjen knopp deretter løsner fra endoderm, utvides bilateralt for å smelte ved e13.5 med ultimobranchial legemer på hver side av luftrøret. Endelig thyrocytes organisere inn follikler og C-cellene differensieres.

Nåværende kunnskap om skjoldbruskdannelse kommer hovedsakelig fra histologisk analyse av faste vev, men de morphogenetic hendelser involvert i skjoldbruskdannelse er svært dynamisk og involvere kommunikasjon og samhandling mellom ulike celletyper og med den ekstracellulære matrise. Nyere arbeider har vist at thyrocyte progenitorer produsere høye nivåer av VEGF for å rekruttere endotelceller til å utvikle skjoldbruskkjertelen, og i sin tur rekruttert endotelceller fremme follicle dannelse og C-celler differensiering ^7..

De fleste ex vivo studier på skjoldbruskkjertelen har blitt utført på isolerte voksne skjoldbrusk-avledet celler, dyrket enten på 2D vev kultur plast dønsker flere kvinner eller i 3D-matriser. Ved hjelp av disse typer kulturer, differensierte follikkelcellene enten forbli polarisert og organisert som follikler eller gjenanskaffe en 3D organisasjon ^8-10. Men disse rene epitelceller, eksplanterte fra deres fysiologisk miljø, og dyrket i 2D, ignorerer interaksjon med ekstracellulære matriks, cytokiner, vekstfaktorer og med andre celletyper slik som endotel-celler, eller nerver som de normalt støter på in vivo. En veldig fin studie nylig beskrevet en differensiering protokoll av ES-celler i skjoldbrusk follikler ved hjelp av en endelig kultur skritt i 3D matrigel ^11. Men disse 3D-kulturer mangler kontakt med andre celletyper.

Basert på tidligere kompetanse på bukspyttkjertel og spyttkjertler organ kultur ^12-14, en metode for å dissekere mus embryonale thyroid anlagen og dyrking explants på halvporøst filtre eller på mikros plast lysbilder ble utviklet.

Nårarbeider med E12.5 embryo, den doble opprinnelsen til skjoldbrusk anlagen (midtlinjen anlage og de to laterale ultimobranchial organer) innførte microdissection av et stort fragment av vev. Dette inneholdt i luftrøret, men ikke i spiserøret, og forlenget fra svelg-bue arterier opp til arytenoid hevelse. Når dyrket på filtrene, strekker midtlinjen anlage lateralt på hver side av luftrøret, hvor de smelter sammen med den ultimobranchial organer for å danne de to thyroid fliker, fremdeles forbundet med en landtunge.

I kultur, epitelceller spre seg, organisere i folliklene og differensiere i thyrocytes og C-celler, avhengig av deres opprinnelse. Endotelceller som finnes i microdissected vev også spre seg og invadere skjoldbrusk lapper til slutt knytte tett med epitel follicular struktur, uavhengig av blodstrøm eller sirkulerende faktorer. Som utviklingen av eksplantater trofast sammenfatter in vivo utvikleling, er dette kultursystem optimalt å studere morfogenetiske og differensierings hendelser som skjer i løpet av thyroid utvikling.

Skjoldbrusk vev kan fås fra villtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoer, og kultur-systemet er mottagelig for tap-og gevinst-av-funksjon eksperimenter. Endelig kunne time-lapse avbildning av fluorescensmerkede skjoldbrusk explants på mikros plast retter utnyttes til å bedre undersøke kinetikk og kontinuitet i morphogenetic bevegelser som skjer in vivo. Time-lapse bildebehandling har allerede blitt brukt til å studere forgrening morfogenese i bukspyttkjertelen ^15,16 eller ureteric knopp ^17.

Protocol

Mus ble hevet og behandlet i henhold til prinsippene i forsøksdyr vare på Universitetet Animal Welfare Committee. Alle prosedyrer og protokoller ble godkjent av denne komiteen. En. Coating av Mikrosplast Kultur Chambers MERK: Utfør alle de følgende trinnene under sterile forhold i en laminær hette. De to typer av belegg er funksjonelt ekvivalente. Coat plast kultur kamre med fibronektin en dag før isolering av skjoldbrusk vev: Fortynn st…

Representative Results

Thyroid anlages (midtlinjen og UB, sammen med omkringliggende vev), og skjoldbrusk lobes er dissekert fra mus embryoer ved E12.5 og e13.5/e14.5, henholdsvis (figur 1). Etter en dag i kultur på filteret, er midtlinjen anlage synlig (figur 2A) som et langstrakt vev som strekker seg på toppen av luftrøret. Den danner progressivt to fliker på hver side av luftrøret. Hvis isolerte skjoldbrusk fliker (e13.5 eller E14.5) er kultivert, vil de utvide, gjennomgå morfogenese og epitelceller …

Discussion

Dette notatet beskriver en metode for å dissekere og dyrking skjoldbrusk eksplantater (E12.5) eller lapper (E14.5) for å studere og bedre forstå de komplekse hendelser som fører til skjoldbruskdannelse. På grunn av den doble opprinnelsen av skjoldbrusk anlagen (midtlinjen anlage, og de to laterale ultimobranchial legemer), og deres lille størrelse, et fragment av E12.5 vev lokalisert rostral til svelg-bue arterier, og inneholdende i luftrøret, men ikke i spiserøret er microdissected. Som illustrert, i løpet av …

Materials

µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile	proxylab	80826
Collagen Type I, rat tail	Millipore	08-115
Fibronectin from human plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Tungsten wire	Goodfellow	LS237450
culture plate insert (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261