이 프로토콜은 쥐 배아 갑상선 항라겐의 해부와 반다공성 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드의 외식자리 배양을 설명합니다. 이 시스템은 야생형 또는 녹아웃 배아의 갑상선 발달 과정에서 발생하는 형태발생학적 또는 분화 현상을 연구하는 데 이상적이며, 이득 및 기능 상실 실험에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
갑상선은 갑상선 호르몬 T3, T4, 그리고 칼시토닌을 생산, 목의 기지에서 지역화 bilobated 내분비 선입니다. 칼시토닌은 모공과 모세 혈관의 밀도가 네트워크 사이에 산재 C-세포에 의해 합성되는 동안 T3와 T4는 여포라는 폐쇄 된 분야로 구성 차별화 thyrocytes에 의해 생성된다. 성인 갑상선 아키텍처 및 기능은 광범위하게 기술되고 연구되어 왔지만, "angio-모낭"단위, 실질에서 C-세포의 분포 및 상피와 내피 세포 사이의 주변 분비 통신의 형성은 작게 이해되는 것이다.
이 방법은 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN 해부와 문화의 순차적 단계를 설명합니다. 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 생체 충실히 갑상선 발달 되풀이되었습니다. 사실, (I) 억원기관의 obation는 (E12.5 외식을 위해)가 발생, (II) 전구체는 여포로 구성하고 극화 (III) thyrocytes와 C-세포가 분화하고, (ⅳ) microdissected 조직의 증식에 존재하는 내피 세포가로 마이그레이션 thyrocytes 그들은 생체 내에서와 마찬가지로 밀접하게 갑상선 엽 (叶), 그리고, 상피 세포와 연결합니다.
갑상선 조직은 야생형, 녹아웃 또는 형광 유전자 변형 배아에서 얻을 수 있습니다. 또한, 면역 염색 및 RT-qPCR에 의해 생체 외 개발이 실시간으로 분석 할 수있다. 문화 항체, 성장 인자, 또는 세포 또는 배양 상청을 차단 억제제의 첨가에 의해 조작 될 수 이식편 또는 배양 언제든지.
하류 전체 마운트 또는 섹션 이미징 및 유전자 발현 프로파일 링 갑상선 O의 형태 형성과 분화 사건을 조작하고 공부를위한 강력한 시스템을 제공에 결합 된 결론, 갑상선 이식편 문화rganogenesis.
서론
갑상선 내피 모세 혈관의 밀도가 네트워크에 둘러싸여 여포라는 독립적 인 상피 분야의 모음입니다. 이 조직은 갑상선 기능 수 : 내피 모세관은 T3와 T4 호르몬 합성에 필요한 요오드와 thyrocytes를 제공하고, 몸 전체에 후자를 배포 할 수 있습니다. 모공과 모세 혈관 사이에 흩어져, C-세포는 1 칼시토닌 hypocalcemic 호르몬을 생산하고 있습니다. 성인 갑상선의 구조와 기능이 잘 알려져 있지만, 갑상선 배아 발달 (뿌리의 형성과 분화)에 관련된 세포 및 분자 메커니즘은 지금까지 이해되지 있습니다.
배 발생시, (C-세포의 전구 세포는 물방울 모양의 돌기로 E11.5에서 시작하는 동안 조상이 배아 일에 foregut의 내배엽의 복부 벽의 비후 (중간 선 anlage) (E) 마우스 배아에서 8.5으로 유래 thyrocytes ultimobranchial 보네 번째 인두 낭 2-6) 죽는다. 중간 선 봉오리는, 내배엽에서 분리 기관의 각 측면에 ultimobranchial기구와 E13.5에서 융합 양측으로 확장됩니다. 마지막으로, thyrocytes는 여포로 구성하고 C-세포는 분화.
갑상선 형성에 대한 현재의 지식은 주로 고정 된 ....
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프로토콜
마우스는 대학 동물 복지위원회의 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 제기 및 처리 하였다. 모든 절차 및 프로토콜은이위원회에 의해 승인되었다.
1. 현미경 플라스틱 문화 챔버의 코팅
참고 : 층류 후드에서 무균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. 코팅의 두 종류가 기능적으로 동일하다.
- 피브로넥틴 전에 갑상선 조직을 분리 한 하루 코트 플라스틱 문화 실 :
- 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.25 ㎍ / ㎖의의 fungizone 2 MM의 글루타민 (12)와 보충 M199 배지에서 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 멸균 피브로넥틴을 희석.
- 희석 피브로넥틴의 200 μL와 우물을 덮고 4 ° C의 냉장고에 하룻밤 배양한다.
- 해부의 날, M1에 한 번 우물을 씻어, 피브로넥틴을 대기음99 및 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 M199 200 μL의 최소 부피를 추가한다.
- 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요.
- 유형 코트 플라스틱 문화 챔버 나는 갑상선 조직을 ....
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결과
갑상선 anlages (중간 선 및 UB 함께 주위 조직과), 갑상선 엽 (叶)은 각각 E12.5 및 e13.5/e14.5에서 마우스 배아 (그림 1)에서 해부된다. 필터에 문화에서 하나의 하루를 보낸 후, 중간 선 anlage는 기관의 상단에 걸쳐 연장 된 조직으로 (그림 2A)를 볼 수 있습니다. 그것은 점진적으로 기관의 각 측면에 두 개의 엽 (叶)을 형성한다. 고립 된 갑상선 엽 (叶) (E13.5 또는 E14.5)이 배양, 그들은 확장 형태 형성과 상피 세포가 거시적으로 볼 여포 구조 (그림 2B)로 구성됩니다 받게 될 것이다.
조직 및 E-cadherin의 레이블이 상피 세포의 편광, ezrin의 immunolabeling (그림 3A)에 의해 시각하실 수 있습니다. Ezrin 양성 세포 내 구조를 점진적으로, 그리고 공동의 방법으로, 꼭대기의 .......
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토론
이 논문은 해부 갑상선 형성으로 이어지는 복잡한 이벤트를 공부하고 더 잘 이해하기 위해 갑상선 외식 (E12.5) 또는 돌출부 (E14.5)를 배양하는 방법을 설명합니다. 인해 갑상선 ANLAGEN (정중선 anlage 및이 횡 ultimobranchial 체), 및 그 작은 크기, 인두 아치 동맥 E12.5 조직 지역화 주동이의 단편, 및 기관을 포함하는, 그러나 식도의 이중 원점 microdissected 있습니다. 도시 된 바와 같이, 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 충실히 이후 생체 내 갑상선 발달 되풀이되었습니다 : (ⅰ) 정중선 anlage는 양측 마이그레이션 및 UB로, 좁은 지협에 의해 연결된 두 개의 갑상선 돌출부 (도 2A)를 형성하도록 해 (II) 전구체는 갑상선 여포 세포로의 질량으로부터 재구성 궁극적 소재 (III) 내피 세포가 존재하는 (도 2b 및도 3a)을 편광microdissected 조직의 증식은 갑.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Université catholique de Louvain(Action de recherché concertées)과 Fund for Scientific Medical Research(F.R.S.-FNRS, 벨기에)의 보조금으로 지원되었습니다. A.-S.D.는 A.-C.H. 텔레비의 박사 과정 연구원입니다. 벨기에 농업 재단(Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture)의 펠로우십을 받았고, M.V.는 드 듀브 연구소(de Duve Institute)의 지원을 받았으며, C.E.P.는 벨기에 F.R.S.-FNRS의 선임 연구원이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| &마이크로;-슬라이드 8 웰, ibiTreat, 조직 배양 처리, 멸균 | proxylab | 80826 | |
| 콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리 | Millipore | 08-115 | |
| 인간 혈장에서 추출한 피브로 | 넥틴 Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| 텅스텐 와이어 | Goodfellow | LS237450 | |
| 배양 플레이트 인서트 (직경 12mm) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | 시그마 | B2261 |
참고문헌
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M.
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재인쇄 및 허가
