Summary

Использование флуоресцентных белков для мониторинга Glycosome Динамика в африканском трипаносомы

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei является kinetoplastid Паразит, вызывающий африканским трипаносомозом человека (HAT), или сонная болезнь, и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота 1. Паразит чередует кровоток хозяина млекопитающих и мухи вектора лету. Состав многих клеточных органелл изменяет в ответ на эти различные внеклеточных условиях 2-5.

Glycosomes являются узкоспециализированными пероксисомы, в котором многие из ферментов, участвующих в гликолиза являются разобщенным. Glycosome состав изменяется в развития и экологически регулируемым образом 4-11. В настоящее время наиболее общие методы, используемые для изучения glycosome динамику являются электрон и флуоресцентной микроскопии; методы, которые стоят дорого, времени и труда, а не легко адаптировать к высокой пропускной анализов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, репортер систему люминесцентная-glycosome вкоторой повышена желтый флуоресцентный белок (EYFP) слита с последовательностью ориентации пероксисом (PTS2), который направляет слитый белок по glycosomes 12, было установлено. При импорте слитого белка PTS2eYFP, glycosomes стать люминесцентные. Деградации органелл и результаты переработки в потере флуоресценции, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии. Большое количество клеток (5000 клеток / сек) могут быть проанализированы в реальном времени без обширного пробоподготовки, например, фиксации и монтажа. Этот метод предлагает быстрый способ обнаружения изменений в органелл состава в ответ на колебания условий окружающей среды.

Introduction

Trypanosoma brucei вызывает африканскую сонную болезнь у человека и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота. Препараты, применяемые при лечении этих заболеваний являются устарелыми и чрезвычайно токсичны, вакцины отсутствуют, и потенциал для развития лекарственной устойчивости к необходимости поиска новых лекарственных препаратов 1.

Во время его жизненного цикла, Т. brucei, чередует вектор насекомых и млекопитающему; два компьютера, которые представляют очень разные условия, в которых паразит должен выжить. Ряд метаболических и морфологических изменений произойти паразит подвергается различным условиям окружающей среды. Некоторые из самых драматических изменений наблюдаются в одной мембраной ограничена паразитов конкретных микротел, называется glycosomes 13.

Уровни глюкозы являются относительно высокими (~ 5 мм) в крови и кровотока паразиты (BSF) генерации АТФ исключительно через гликолиза WHИль митохондриальная метаболизм репрессированных 14. В отличие от других эукариот, в котором гликолиза происходит в цитоплазме, T. brucei compartmentalizes большинство ферментов гликолиза в glycosomes 14,15. Паразиты будут взяты мухой цеце во время bloodmeal и испытать падение глюкозы, которая падает до неопределяемых уровней в течение 15 мин, чтобы быть заглатывании лету. Метаболизм насекомых, проциклической форма (PCF), паразиты является более гибким и глюкозы, а также аминокислоты, такие как пролин, могут быть использованы в синтезе АТФ 16-18. Сравнительные протеомные исследования показывают жизненного цикла зависимые изменения в glycosomal и митохондриальные белки с гликолиза белков повышенные в кровоток паразитов и митохондриальные белки, участвующие в цикле ТСА и дыхательной цепи 13,19. Хотя многие исследования были сосредоточены на различиях между ЧФ и ФКП glycosomes, мало известно об изменениях в ФКП glycosomes, которые происходят в ответ на окрironmental изменения.

В кишке лету, уровень глюкозы низкий с временными увеличивается во время кормления 20. В большинстве в пробирке исследования, ПКФ паразиты выращивают в среде, содержащей глюкозу. Тем не менее, недавние исследования показали, что изменения ФКП метаболизм значительно в ответ на глюкозу доступность 17. В отсутствие глюкозы, поглощение пролина и пролина увеличение активности дегидрогеназы 18. Это изменение метаболизма митохондрий, вероятно, сопровождается изменением состава и морфологии glycosome, однако, это не было непосредственно оценивать.

Электрон и флуоресцентной микроскопии являются общие методы используются для изучения динамики glycosome в Т. brucei 2,21-24. Эти протоколы времени и труда, дорого, и трудно адаптироваться в режиме реального времени исследований и протоколов с высокой пропускной. Чтобы преодолеть это ограничение, репортер система люминесцентная-органеллы USED для изучения органелл в млекопитающих и дрожжей систем была изменена для использования в T. brucei 12.

Репортер системы Люминесцентная-органелл широко используются в высших эукариот, таких как дрожжи, растений и клеток млекопитающих 25-27. В таких системах, флуоресцентный белок слит с аминокислотной последовательностью, которая направлена ​​белка в определенных органелл. Разложение или синтез целевых белков измеряется с помощью флуоресценции и изменения в составе органелл, отраженных от изменения флуоресценции клеток.

Когда открытая рамка считывания повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) сливают с Тип II пероксисомальной последовательности целевых ориентиров (PtS2) 12, белок PTS2eYFP импортируется в зрелых, импортных-компетентный glycosomes и флуоресценции можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Вариации в glycosome композиции, отраженных от изменений в клеточной флуоресценции. Эта система может помочь в резолВинг механизмы, которые регулируют экологически индуцированных изменений в glycosome состава.

Эта рукопись описывает генерацию системы glycosome репортера в ФКП паразитов в сочетании с проточной цитометрии для мониторинга динамики glycosome в режиме реального времени в живых паразитов и приводит пример, как он был использован, чтобы следить за изменениями в glycosome состава в ответ на различных средах. Таким образом, glycosome состав зависит от внеклеточных концентраций глюкозы и прохождения лог-фазовых культур в свежую среду вызывает изменения во glycosome состава. Эта система может быть изменен, чтобы изучить динамическое поведение других органеллах в трипаносом и других паразитов.

Protocol

1 Общие трипаносом Husbandry Взвесьте твердые для SDM79 подготовки медиа (Таблица 1). Хранить при 4 ° С в 50 мл коническую или Ziploc мешок. ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты стабильны в течение не менее 6 месяцев. Оттепели фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 37 ° C водяной бане, и перемешивают…

Representative Results

В этой системе, наблюдалось изменение уровня глюкозы в зависимости от glycosome в композиции. Когда клетки выращивают в глюкозы, содержащего СМИ, наблюдаются две популяции; одна яркая и одна тусклый (2А). Dim клетки укрывает незрелые glycosomes, которые не импортировали PTS2eYFP а яркие клетки…

Discussion

Glycosomes являются важными, динамические, паразит-специфический органеллы. Процессы, которые регулируют биогенеза, техническое обслуживание, пролиферацию и ремоделирование этих органелл, вероятно, включать лекарственных целей, которые могли бы быть использованы в терапевтических целях….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

Materials

Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium Chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium Chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer  Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell  Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae – new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi’s glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).

Play Video

Cite This Article
Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

View Video