Denna video artikeln beskrivs hög genomströmning pipeline som har upprättats för att infektera och analysera stora mängder zebrafisk embryon som ger ett nytt kraftfullt verktyg för förening testning och läkemedelsutveckling med hjälp av en hel djur ryggradsdjur organism.
Zebrafish blir ett värdefullt verktyg i den prekliniska fasen av läkemedelsutveckling filmvisningar som helhet djurmodell med hög kapacitet möjligheter. De kan användas för att överbrygga gapet mellan cellbaserade analyser på tidigare stadier och in vivo validering i däggdjursmodeller, minska, på detta sätt, att antalet föreningar som passerar genom att testa på de mycket dyrare gnagarmodeller. I ljuset av detta, i detta manuskript beskrivs en ny hög genomströmning rörledning med hjälp av zebrafisk som in vivo modellsystem för studier av Staphylococcus epidermidis och Mycobacterium marinum infektion. Denna inställning gör det möjligt för generering och analys av ett stort antal synkrona embryon homogent smittade. Dessutom flexibiliteten hos rörledningen tillåter användaren att enkelt implementera andra plattformar för att förbättra upplösningen av analysen när det behövs. Kombinationen av zebrafisk tillsammans med innovativa hög genomströmning technologies öppnas området för drogtestning och upptäckter till nya möjligheter inte bara på grund av styrkan av att använda en hel djurmodell, utan också på grund av det stora antalet transgena linjer tillgängliga som kan användas för att dechiffrera den verkningsmekanismen för nya föreningar.
Hittills zebrafisk (Danio rerio) har upprättats som en effektiv modell för att studera en mängd olika infektionssjukdomar 1. Den zebrafisk embryot erbjuder unik in vivo imaging möjligheter på grund av sin öppenhet och det stora antalet befintliga transgena reporter linjer som uttrycker fluorescerande proteiner. Denna kraftfulla kombination gör det möjligt att spåra olika immuncelltyper i tid samtidigt interagera med patogener som Mycobacterium marinum, närmaste släkting M. tuberkulos 2, eller Staphylococcus epidermidis, den viktigaste orsakande av biomaterial tillhörande infektion 3-5. Olika smittvägar kan användas i zebrafisk embryon beroende på syftet med studien 6.
En av dessa smittvägar är äggula injektion av bakterierna. Den största fördelen med denna metod jämfört med de andra är att äggula Infectiden kan utföras automatiskt via robot injektion, vilket avsevärt minskar insprutningstiden och möjliggör hög reproducerbarhet av infektionen 7, 8.
Tidigare arbete med användning av zebrafisk som en hög genomströmning in vivo modellsystem för studier av S. epidermidis och M. marinum infektion visade sig vara framgångsrik 7, 8. Detta system har möjlighet att screena för sjukdomsprogression via robot äggula injektion av tidiga embryon och använda fluorescens avläsning som ett mått för bakteriehalten. I överenskommelse med detta begrepp, har denna inställning optimerats och etablerat en mycket effektiv hög genomströmning pipeline med potential att generera ett stort antal homogent infekterade embryon och spåra utvecklingen av infektionen under den tid efter behandling med ett antal föreningar. Med den etablerade inställningen är det möjligt att generera upp till 8.000 synkrona embryon till skärmenför sjukdomsprogression, behandling på detta sätt upp till 2.500 embryon per timme. Embryon är sorterade utifrån deras bakteriehalten med hjälp av ett automatiserat system, se till homogena grupper av infekterade larver. Dessutom, för att validera setup, effekter av referens kända för att förhindra progression tuberkulos hos däggdjur har testats på embryon infekterade med M. marinum E11 stam eller mer virulent M stam 9.
Denna studie beskriver i detalj hög genomströmning pipeline som har inrättats för att kunna generera ett stort antal infekterade embryon och den efterföljande analysen av den bakteriella progression under utveckling och efter förening behandling.
Den hög genomströmning metod som beskrivs i detta dokument ger en snabb och kostnadseffektiv pipeline för att avskärma stort antal fisk embryon och larver med olika typer av infektioner. Med hjälp av stora odlingskassen istället för traditionella enkla eller familj avelstankar lättade kontrollen av lekande processen och generering av större antal synkrona ägg. Med en förbättrad version av den automatiserade mikroinjektionssystem 7, är det möjligt att injicera upp till 2500 ägg nästan alla i samma cellstadiet inom en timme. Med dessa uppdateringar och förbättrad programvara är det möjligt att injicera fler ägg än vad som tidigare var möjligt, som kan användas för att utföra stora läkemedels skärmar med bakteriespridning som läste upp. Denna metod är emellertid fortfarande begränsad till äggula injektion, andra injektionsvägar beskrivs exempelvis av Benard et al. (2012) 6, kommer förhoppningsvis att införlivas i den automatiserade mikroinjektionssystem i en nära framtid.
<p class = "jove_content"> Även om dessa metoder är riktmärke för screening av zebrafisk, skulle det vara användbart för applikationer med andra fiskarter också. Till exempel har den karp indikerats att ha fördelar för drogskärmar. Liksom zebrafisk, ägg och scenembryon tidigt från karp är transparenta men med den största fördelen med dess stora spawn storlek hundra tusen ägg och tillgängligheten av inavlade linjer som ger en mer konstant genetisk bakgrund 16.Analysen av stora mängder infekterade embryon sker med hög genomströmning stor partikel flödescytometer. Den här enheten kan sortera analyserade embryon i flera brunnar eller en petriskål vilket gör den speciellt lämplig för att testa ett stort antal föreningar. Om det krävs ett högre imaging upplösning, än installationen är anpassad så att den stora partikel flödescytometerns teknik kan användas för pre-screening och därefter analysera proverna på ett medium genomsätta på en högre upplösning. Detta kan göras med hjälp av ryggradsdjur Automated Screening Technology 17, 18. Den här enheten kan automatiskt samla in levande eller fasta embryon mellan 2 och 7 dagar efter befruktningen från en flerbrunnsplatta eller bulk container, bild 360 ° genom en kapillär med hjälp CLSM eller stereomikroskop och avyttra igen i 2 bulkcontainrar som möjliggör manuell sortering av embryon baserade på de mikroskopiska bilderna. Framtida förbättringar kommer att möjliggöra sortering av embryot efter avbildning i flera brunnar, vilket gjorde det möjligt att skärmen automatiskt stort antal enskilda embryon över tiden med CLSM. Om man antar att i framtida tillämpningar ryggradsdjur Automated Screening Technology-systemet kan också kopplas till den stora partikel flödescytometer teknik utan behov av föregående dispense larver i flera brunnar, kommer att leda till en mer avancerad sortering.
Detta dokument beskriver etableringen ettd optimering av en hög genomströmning setup för att studera S. epidermidis och M. marinum infektion som en modell för läkemedelsforskning. Det visar att resultatet av dessa bakterier injiceras i gulan beror på utvecklingsstadiet av äggen vid tiden för injektion. Injektion av M. marinum E11 vid 16-128 cellstadiet eller M töjningen vid 16-64 cellstadiet leder till samma infektion mönster som kaudalvenen injektion 2, 6. Denna inställning är dock inte begränsad till spridningen av endast bakteriella patogener. Det visades tidigare att det är möjligt att robot injicera lösningar som innehåller DNA, RNA eller morpholinos för genmodifiering, över-uttryck och gen knock-down studier, respektive 13. Vidare visade det sig att denna installation är också användbara för studier av cancercellproliferation och migration. Därför denna rörledning uppvisar en mångsidig metod för hög genomströmning skärmar av en variation av signalmekanismer inom ramenav medfödd immunitet, appliceras på infektionssjukdomar och utvecklingen av cancer. Dessa skärmar kan kombineras med andra för medicin upptäckt men också med analys av eventuella toxiska effekter av identifierade gällande droger.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Leonie de Boer och Bas Zaat (Academic Medical Centre) för att förse oss med S. epidermidis O-47-stammen. Vi tackar Rico Bongaarts, Francis Smet och Angela Comas (Union Biometrica) för att få hjälp och råd med Copas XL och VAST BioImager analys. Vi tackar Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, och Laura van Hulst för fisk fastighetsskötsel, och andra kollegor från Leiden University för bra diskussioner. Denna forskning är en del av projektet P5.03 IBIZA av forskningsprogrammet för biomedicinska material institutet, som delvis finansieras av det nederländska ekonomiministeriet, och Smart Mix Program (NWOA_6QY9BM) i Nederländerna ekonomiministeriet och av Nederländerna Ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap. Ytterligare stöd erhölls från EU-projektet ZF-Hälsa (FP7-hälsa-2009 till 242.048), och RMJ stöddes av Marie Curie-stipendium som erfaren forskare i EU-nätverket för grundutbildning FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR fått finansiering från Innovative gemensamma företaget för initiativet enligt bidragsavtal nr 115337, av vilka resurser som består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) och EFPIA företag i natura contribution.The författare ytterligare bekräftar ekonomiskt stöd från Leiden University fonden (LUF) för robotteknik och från Cyttron, i Besluit Subventioner Investeringen Kennisinfrastructuur program, som i sin tur stöds ekonomiskt av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning för avbildning anläggningar. De Copas systemet Förvärvet har delvis stöd av avdelningen för jord-och biovetenskap (ALW) med ekonomiskt stöd från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO, 834.10.004).
Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |