测量渗透水渗透系数（P<sub> F</sub>）球形细胞：隔离植物原生质体为例。
Summary
测量细胞的渗透水的渗透系数（P F）可以帮助理解水通道蛋白的调节机制（水通道蛋白）。在这里介绍的球形植物细胞原生质体P F决心涉及原生质体的分离和体积变化的过程中不断的浴灌注渗透挑战，因此他们的初始速度的数值分析。
Abstract
研究水通道蛋白调控机制是水的关系的同时在细胞和整个植株水平的理解是至关重要的。这里介绍的是用于渗透水渗透系数（P f）如植物原生质体，适用于原则也适用于其他的球形细胞，如蛙卵母细胞的判定的简单和非常有效的方法。在测定法的第一步骤是从通过酶消化感兴趣的植物组织原生质体的分离与适当的等渗溶液的腔室。第二步骤包括渗透压挑战测定：原生质体固定在所述腔室的底部是通过低渗溶液提交的恒定灌注起始用的等渗溶液和遵守。细胞肿胀是录制的视频。在第三步骤中，图像脱机进行处理，以产生体积变化，体积变化的时间过程密切相关，在osmola的变化的时间过程RITY（安全）腔灌注介质，使用MATLAB写的（以下简称“PfFit'）的曲线拟合程序，以产生P F。
Introduction
跨细胞膜的吸水率以及流量为植物存在于两者的细胞和整个植株水平的基本要求。在细胞水平上，水通道蛋白（水通道蛋白）发挥细胞膜1-3的渗透水渗透系数（P F）的调节中发挥关键作用。
至今，几种方法已被用于测定原生质体的内源P F从不同植物器官（ 如根，叶肉，内皮等 ，由肖蒙等 4中综述）。一种测量P F的方法之一是将原生质体暴露于渗透挑战，并监测其体积变化的初始速率（ 即 ，体积变化的早期线性相的斜率）。两种不同的方法根据该方法，以前描述的，两者都基于解决方案的瞬时交流。第一种是由immobiliz的荷兰国际集团的吸入微量的原生质体和开关的溶液流5和转移的原生质体从一种溶液到另一个使用微量6中的第二个。这些微量吸管和微量转移的方法，它允许在快速的解决方案交流的一开始图像采集（采集量变化的早期线性相位），可能涉及到的物理应力原生质体，并且需要专门的设备和专家的显微操作。
这里所描述的方法最大限度地减少了干扰的细胞，不涉及显微和允许的P F推导当浴灌注不是瞬时的。
酶消化后，将原生质体，浸没在等渗溶液中，被固定在有机玻璃的盖玻片玻璃底部（又名有机玻璃或有机玻璃）腔室通过电荷相互作用。然后，在一个恒定浴灌注，等渗溶液用低渗溶液产生低渗挑战原生质体冲走。原生质体的膨胀是视频记录，然后，通过结合约浴灌注的时间过程和细胞肿胀的时间过程中的信息时，P f由图像处理和曲线拟合程序确定。
这种方法的优点是，该实验是非常有效的， 即有可能在一个单一的检测同时监视几个细胞，并且它不需要特殊的设备或特别的显微操作技能。几个应用本方法也是可能的。例如，测定各种不同组织和植物，如叶肉细胞的天然P F和束从拟南芥叶片7，玉米叶肉或根皮层细胞8-10或悬浮培养的细胞11,12鞘细胞。在additi上，所以能够确定球形动物细胞的P F如卵母细胞11。另一个例子涉及到检查AQP活性通过基因的原生质体（或任何其他基因，其可能影响他们; 例如 ，激酶的基因）的瞬时表达及其对P F的贡献和判定;例如，番茄水通道蛋白SlTIP2的表达; 2拟南芥原生质体用PEG转化和决心SlTIP2; 2相关P F 13。最后，检查在不同的分子/物质P F（药物，激素等）的影响加入到溶液也进行检查，例如在水通道蛋白阻滞剂升汞 7。
以下方案描述拟南芥叶肉细胞和测定它们的P F的原生质体的分离。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的是测量分离的植物原生质体的P F，适用的原则也适用于其他的球形细胞， 如 ，蛙卵母细胞11一个简单而非常有效的方法。这个方法是基于测量的P F响应于渗透压挑战到细胞。相反，基于这种方法的其它方法，然而，溶液的渗透压摩尔浓度的变化， 即 ，不是瞬时的，而是渐进的，在一个恒定的浴灌注，首先是等渗的溶液，其中，所述基线细胞体积?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由比利时国家基金资助科学的调查一下（FNRS），校际景点波兰人计划 – 比利时科学政策和“Communauté法语培训中心比利时，操作德RecherchesConcertées”到FC，从以色列科学基金会耶路撒冷（支持ISF），以MM（格兰特＃1311至1312年），以及新墨西哥州（格兰特＃1312至1312年）。
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
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