La mesure de la perméabilité à l'eau Coefficient osmotique (P<sub> F</sub>) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple
Summary
La mesure du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de cellules peut aider à comprendre les mécanismes de régulation de aquaporines (AQP). P f détermination dans des protoplastes de cellules végétales sphériques présentées ici implique l'isolement de protoplastes et l'analyse numérique de leur taux initial de changement de volume à la suite d'une faute de osmotique au cours de la perfusion de bain constant.
Abstract
L'étude des mécanismes de régulation PAQ est cruciale pour la compréhension des relations de l'eau, tant au niveau de la plante entière et cellulaire. Présenté ici est une méthode simple et très efficace pour la détermination du coefficient de perméabilité à l'eau osmosée (P f) dans des protoplastes végétaux, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques telles que les ovocytes de grenouille. La première étape de l'analyse est l'isolement de protoplastes à partir du tissu de la plante d'intérêt par digestion enzymatique dans une chambre avec une solution isotonique appropriée. La deuxième étape consiste en un test de provocation osmotique: protoplastes immobilisés sur le fond de la chambre sont soumises à une perfusion constante de départ avec une solution isotonique et suivis par une solution hypotonique. Le gonflement de la cellule est une vidéo enregistrée. Dans la troisième étape, les images sont traitées hors ligne pour donner des changements de volume, et l'évolution dans le temps des changements de volume sont corrélées avec l'évolution temporelle de la variation de la osmolarité de la chambre à fluide de perfusion, en utilisant une procédure d'ajustement de courbe écrit dans Matlab (la PfFit '), pour obtenir P f.
Introduction
L'absorption d'eau et le débit à travers les membranes cellulaires est une exigence fondamentale pour l'existence de l'usine à la fois au niveau de la plante entière et cellulaire. Au niveau cellulaire, les aquaporines (AQP) jouent un rôle clé dans la régulation du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de la membrane de la cellule 1-3.
A ce jour, plusieurs procédés ont été utilisés pour mesurer la f P endogène de protoplastes à partir de différents organes de la plante (par exemple les racines, le mésophylle, endoderme, etc., Examiné par Chaumont et al. 4). L'une des approches pour mesurer P f est d'exposer les protoplastes à un défi osmotique et à contrôler la vitesse initiale de sa variation de volume (c.-à-., La pente de la phase précoce, linéaire de la variation de volume). Deux méthodes différentes ont été décrites précédemment sur la base de cette approche, tous les deux basés sur un échange instantané de solutions. La première consiste à immobilizment le protoplaste avec une micropipette d'aspiration et le passage du flux de la solution 5 et la deuxième consistant à transférer l'un protoplaste d'une solution à l'autre à l'aide d'une micropipette 6. Ces méthodes de transfert micropipette d'aspiration et de micropipette, qui permettent l'acquisition d'images au début de l'échange de solution rapide (pour capturer la phase linéaire début de changement de volume), impliquera probablement un stress physique de protoplastes et nécessitent un équipement spécialisé et micromanipulation expert.
Le procédé décrit ici minimise la perturbation des cellules, comporte aucun micromanipulation et permet la dérivation de P f lorsque la perfusion de bain n'est pas instantanée.
Après la digestion enzymatique, les protoplastes, immergées dans une solution isotonique, sont immobilisés sur le fond de la lamelle couvre-objet en verre une Plexiglas (aka Lucite ou plexiglas) chambre par interaction de charges. Puis, au cours d'une perfusion constante de bain,la solution isotonique est rincée par la solution hypotonique générer un défi hypoosmotique aux protoplastes. Le gonflement du protoplaste est une vidéo enregistrée et ensuite, en combinant les informations sur le déroulement dans le temps de la perfusion de bain et le déroulement dans le temps de gonflement de la cellule, le P f est déterminée par traitement d'image et des procédures d'ajustement de courbe.
Les avantages de cette méthode sont que l'expérience est très efficace, c'est à dire qu'il est possible de suivre quelques cellules simultanément dans un seul essai, et qu'il ne nécessite pas d'équipement spécial ou des compétences particulières de micromanipulation. Plusieurs applications de cette méthode sont possibles. Par exemple, la détermination de P f natif d'une variété de cellules provenant de différents tissus et des plantes, tels que mésophylle et regrouper les cellules de la gaine de feuille 7 Arabidopsis, maïs mésophylle des feuilles ou des cellules du cortex des racines 8-10 ou les cellules cultivées en suspension 11,12. En additisur, il est possible de déterminer P f de cellules animales telles que des cellules sphériques d'ovocytes 11. Un autre exemple concerne l'examen de l'activité PAQ par l'expression transitoire de leur gène dans les protoplastes (ou d'autres gènes susceptibles de les toucher; par exemple, les gènes de kinases) et la détermination de leur contribution à P f; par exemple, l'expression de tomate AQP SlTIP2; 2 dans les protoplastes d'Arabidopsis de PEG par transformation et la détermination SlTIP2; deux liés P f 13. Enfin, l'examen de l'effet sur P f de différentes molécules / substances (médicaments, hormones, etc) ajouté à des solutions peuvent également être examinée, par exemple du bloqueur PAQ HgCl2 7.
Le protocole suivant décrit l'isolement de protoplastes des cellules et la détermination de leur P f Arabidopsis de.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décrit ici est un procédé simple et très efficace pour la mesure de la P f de protoplastes végétaux isolés, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques, par exemple., Les ovocytes de grenouille 11. Cette méthode est basée sur la mesure de la P f en réponse à un défi osmotique de la cellule. A la différence des autres méthodes basées sur cette approche, cependant, le changement de solutions, à savoir, d'osmolarité, n'est pas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds national belge pour scienti fi de la recherche (FNRS), l'Pôles d'attraction interuniversitaires Programme-belge Politique scientifique et les «Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées" FC, de la Fondation Israël science Jérusalem ( ISF) à MM (Grant # 1311-1312), et à NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
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