Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub> F</sub>) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel
Summary
Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizienten (P f) der Zellen können helfen zu verstehen, die Regulationsmechanismen der Aquaporine (AQPs). P f die Bestimmung der sphärischen Pflanzenzellprotoplasten Protoplasten umfasst hier dargestellten Isolierung und numerische Analyse der anfänglichen Rate der Volumenänderung als Folge eines osmotischen Herausforderung bei konstanter Badperfusion.
Abstract
Studium AQP Regulationsmechanismen ist entscheidend für das Verständnis der Wasser Beziehungen sowohl auf der zellulären und der gesamten Anlage Ebenen. Dargestellt ist hier die einfache und sehr effiziente Methode zur Bestimmung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten (P f) in Pflanzenprotoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen wie Frosch-Oozyten. Der erste Schritt des Assays ist die Isolierung von Protoplasten aus dem Pflanzengewebe von Interesse durch enzymatischen Verdau in eine Kammer mit einer geeigneten isotonischen Lösung. Der zweite Schritt besteht aus einem osmotischen Herausforderung Assay: Protoplasten am Boden der Kammer immobilisiert sind, um eine konstante Ausgangs Perfusion durch einen hypotonischen Lösung vorlegt, mit einer isotonischen Lösung und gefolgt. Die Zellschwellung ist Video aufgezeichnet. Im dritten Schritt werden die Bilder offline verarbeitet, um Volumenänderungen zu erhalten, und der Zeitverlauf der Volumenänderungen mit dem Zeitverlauf der Änderung in osmola korreliertheit der Kammer Perfusionsmedium mit einem Kurvenanpassungsverfahren in Matlab (die 'PfFit') geschrieben, um P f ergeben.
Introduction
Wasseraufnahme und Fluss durch Zellmembranen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Pflanzen Existenz sowohl auf zellulärer und die ganze Pflanze Ebenen. Auf zellulärer Ebene, Aquaporine (AQPs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizient (P f) der Zellmembran 1-3.
Bisher wurden mehrere Verfahren zur Messung der endogenen P f Protoplasten aus verschiedenen Pflanzenorganen verwendet worden (dh Wurzeln, Mesophyll endodermis usw. Durch Chaumont et al. 4 Bewertung). Einer der Ansätze zur P f zu messen, um die Protoplasten zu einer osmotischen Herausforderung freizulegen und um die anfängliche Rate der Volumenänderung zu überwachen (dh., Die Steigung der linearen Phasen Anfang der Volumenänderung). Zwei verschiedene Verfahren wurden bisher für die dieser Ansatz beschrieben, die beide auf einer momentanen Austausch von Lösungen. Die erste besteht aus immobilizing Protoplasten mit einem Sog Mikropipette und Umschalten der Lösungsstrom 5 und dem zweiten der Übertragung der Protoplasten von einer Lösung zur anderen mit einer Mikropipette 6. Diese Mikropipette Saug-und Mikropipette Übertragung Methoden, die Bildaufnahme ganz am Anfang der schnellen Lösung Austausch zu ermöglichen (die frühe Phase der linearen Volumenänderung zu erfassen), wahrscheinlich beinhalten eine körperliche Belastung zu Protoplasten und erfordern spezielle Ausrüstung und Experten der Mikromanipulation.
Das hier beschriebene Verfahren minimiert die Störung der Zellen, schließt keine Mikromanipulation und ermöglicht die Ableitung von P f, wenn die Badperfusion nicht augenblicklich.
Nach der enzymatischen Verdauung, die Protoplasten in einer isotonischen Lösung eingetaucht ist, sind auf dem Deckglas Boden einer Plexiglas (aka Lucite oder Plexiglas) Kammer, die durch Ladungs-Wechselwirkung immobilisiert. Dann wird während einer konstanten Badperfusion,die isotonische Lösung entfernt von einer hypotonischen Lösung Erzeugung eines hypoosmotischen Herausforderung für die Protoplasten gespült. Die Quellung des Protoplasten ist Video aufgezeichnet und dann durch Kombinieren der Informationen über den Zeitverlauf der Badperfusion und der Zeitverlauf der Zellschwellung, die P f wird durch die Bildverarbeitung und Kurvenanpassungsverfahren bestimmt.
Die Vorteile dieses Verfahrens sind, dass das Experiment ist sehr effizient, das heißt es ist möglich, einige Zellen gleichzeitig in einem einzigen Assay zu überwachen, und dass es keine spezielle Ausrüstung oder insbesondere Mikromanipulationsfähigkeiten erfordern. Mehrere Anwendungen für diese Methode sind möglich. B. Bestimmung der nativen P f eine Vielzahl von Zellen aus verschiedenen Geweben und Pflanzen, wie Mesophyll und Bündelscheidenzellen aus Arabidopsis Blatt 7, Maisblatt Mesophyllzellen oder Wurzelcortexzellen 8-10 oder Suspensionskulturzellen 11,12. In Additiauf, ist es möglich, P f des sphärischen Tierzellen wie Eizellen Zellen 11 zu bestimmen. Ein weiteres Beispiel ist der Prüfung AQP-Aktivität durch transiente Expression ihrer Gens in den Protoplasten (oder andere Gene, die sie beeinflussen können, zB Gene von Kinasen) und Bestimmung von deren Beitrag zur P f; beispielsweise die Expression von Tomaten AQP SlTIP2, 2 in Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten durch PEG-Transformation und die Entschlossenheit der SlTIP2, 2 bezogenen P f 13. Schließlich Prüfung der Wirkung auf P f verschiedener Moleküle / Substanzen (Medikamente, Hormone, etc.) zugegeben, um die Lösungen können ebenfalls untersucht werden, zum Beispiel der AQP Blocker HgCl 2 7.
Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von Protoplasten von Arabidopsis Mesophyllzellen und die Bestimmung ihrer P f.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschrieben wird hier ein einfaches und sehr effizientes Verfahren zur Messung der P f der isolierten pflanzlichen Protoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen, zB., Froschoozyten 11. Diese Methode basiert auf der Messung der P f in Reaktion auf eine osmotische Herausforderung an die Zelle. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die auf diesem Ansatz ist jedoch die Änderung von Lösungen, dh der Osmolarität, nicht plötzlich, sondern allmählich, währen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen Nationalfonds für Scientific Forschung (FNRS), das Interuniversitäre Attraktion Polen Programm-belgischen Wissenschaftspolitik und die "Communauté française de Belgique-Aktionen de Recherches Concertées" zum FC, von der Israel Science Foundation Jerusalem (unterstützt ISF) zu MM (Grant # 1311-1312) und NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
