Misurare il osmotica dell'acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub> F</sub>) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio
Summary
Misurare il coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) delle cellule può aiutare a capire i meccanismi di regolazione delle acquaporine (AQPs). P determinazione F in protoplasti di cellule vegetali sferiche qui presentati coinvolge protoplasti isolamento e l'analisi numerica dei loro tasso iniziale di variazione di volume a seguito di una sfida osmotico costante durante il bagno di perfusione.
Abstract
Studiare AQP meccanismi di regolazione è fondamentale per la comprensione delle relazioni idriche sia a livello cellulare e tutto il livello dell'impianto. Presentato qui è un metodo semplice e molto efficace per la determinazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) in protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche come oociti di rana. Il primo passo del saggio è l'isolamento di protoplasti dal tessuto vegetale di interesse mediante digestione enzimatica in una camera con una soluzione isotonica adeguata. La seconda fase consiste in un saggio sfida osmotica: protoplasti immobilizzati sul fondo della camera vengono sottoposti ad una partenza perfusione costante con una soluzione isotonica e seguiti da una soluzione ipotonica. Il gonfiore cella è il video registrato. Nella terza fase, le immagini vengono elaborate in linea per produrre variazioni di volume, e l'andamento temporale delle variazioni di volume è correlato con l'andamento temporale della variazione di osmolarezza del mezzo perfusione camera, utilizzando una curva di raccordo procedura scritta in Matlab (il 'PfFit'), per produrre P f.
Introduction
L'assorbimento di acqua e il flusso attraverso le membrane cellulari è un requisito fondamentale per l'esistenza dell'impianto sia a cellulare e tutto il livello dell'impianto. A livello cellulare, acquaporine (AQPs) giocano un ruolo chiave nella regolazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) della membrana cellulare 1-3.
Ad oggi, diversi metodi sono stati utilizzati per misurare il endogena P f di protoplasti da diversi organi vegetali (ad esempio radici, mesofillo, endodermis, ecc., Recensito da Chaumont et al. 4). Uno degli approcci per misurare P f è quello di esporre i protoplasti di una sfida osmotico e di monitorare il tasso iniziale del suo cambiamento di volume (ad esempio., La pendenza della prima fase lineare della variazione di volume). Due metodi differenti sono stati precedentemente descritti sulla base di questo approccio, entrambi basati su uno scambio istantaneo di soluzioni. Il primo consiste immobilizzione del protoplasti con una micropipetta di aspirazione e commutare il flusso della soluzione 5 e la seconda di trasferimento del protoplasti da una soluzione all'altra utilizzando una micropipetta 6. Questi aspirazione micropipetta e micropipetta metodi di trasferimento, che permettono l'acquisizione di immagini proprio all'inizio dello scambio soluzione veloce (per catturare la prima fase lineare della variazione di volume), probabilmente comportare uno stress fisico per protoplasti e richiedono attrezzature specializzate e micromanipolazione esperto.
Il metodo qui descritto riduce al minimo il disturbo alle cellule, comporta nessun micromanipolazione e permette la derivazione di P f quando la perfusione bagno non è istantanea.
Dopo la digestione enzimatica, i protoplasti, immersi in una soluzione isotonica, sono immobilizzati sul fondo coprioggetto di vetro di un Plexiglass (aka Lucite o perspex) da camera di interazione carica. Poi, durante un bagno perfusione costante,la soluzione isotonica viene lavato via da una soluzione ipotonica generando una sfida ipoosmotico ai protoplasti. Il rigonfiamento del protoplasti è video registrato e quindi, combinando le informazioni sul decorso della perfusione vasca e l'andamento temporale del gonfiore cella, il P f è determinata dalla elaborazione di immagini e procedure di montaggio curva.
I vantaggi di questo metodo sono che l'esperimento è molto efficiente, cioè è possibile monitorare alcune cellule simultaneamente in un singolo test, e che non richiede particolari attrezzature o particolari competenze micromanipolazione. Diverse applicazioni di questo metodo sono possibili. Ad esempio, la determinazione del nativo P f di una varietà di cellule di diversi tessuti e piante, come mesofillo e raggruppare le cellule della guaina di Arabidopsis foglia 7, mais mesofillo foglia o radice cellule della corteccia 8-10 o di sospensione di cellule in coltura 11,12. In additisu, è possibile determinare P f di cellule animali sferiche come le cellule ovociti 11. Un altro esempio riguarda l'esame delle attività di AQP da espressione transitoria della loro gene nei protoplasti (o qualsiasi altri geni che possono influire li, ad esempio, i geni di chinasi) e la determinazione del loro contributo alla P f; per esempio, l'espressione di pomodoro AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesofillo protoplasti di PEG trasformazione e determinazione la SlTIP2; P 2-correlati F 13. Infine, l'esame degli effetti sulla P f di diverse molecole / sostanze (farmaci, ormoni, ecc) ha aggiunto alle soluzioni possono anche essere esaminato, per esempio del bloccante AQP HgCl 2 7.
Il seguente protocollo descrive l'isolamento di protoplasti di cellule e la determinazione del loro P f Arabidopsis mesofillo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descritto qui è una procedura semplice e molto efficace per misurare la P f di isolati protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche, ad es., Oociti di rana 11. Questo metodo si basa sulla misura della P f in risposta ad una sfida osmotica alla cella. A differenza di altri metodi basati su questo approccio, tuttavia, la variazione di soluzioni, cioè, della osmolarità, non è istantanea ma graduale, durante un bagno perfusione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale belga per fi Scienti c Research (FNRS), il Interuniversitario di attrazione polacchi programma-belga Politica della scienza e le "Comunità francese del Belgio-Actions de Recherches Concertées" per FC, dalla Fondazione Gerusalemme Israele Science ( ISF) a MM (Grant # 1311-1312), e NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
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