Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub> F</sub>) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера
Summary
Измерение осмотического коэффициента водопроницаемости (P F) клеток может помочь понять механизмы регулирования аквапоринов (AQPs). Р определение F в сферических протопластов клеток растений, представленных здесь, включает в себя изоляцию протопластов и численный анализ их начальной скорости изменения объема в результате осмотического вызов во время постоянной ванны перфузии.
Abstract
Изучение механизмов регулирования Aqp имеет решающее значение для понимания водных отношений в оба сотовой и целых уровней растений. Представленные здесь является простым и очень эффективным способом для определения осмотического коэффициента проницаемости воды (Р F) в протопластов растений, в принципе применимо и к другим сферических клеток, таких как лягушки ооцитов. На первом этапе анализа является выделение протопластов из растительной ткани интереса ферментативным расщеплением в камеру с соответствующим изотонического раствора. Второй этап состоит из осмотической вызов теста: протопласты иммобилизованные на дне камеры представляются постоянной перфузии, начиная с изотоническим раствором, а затем гипотонического раствора. Ячейка опухоль видеозаписи. На третьем этапе, изображения обрабатываются сообщение с получением изменения объема, и временной ход изменения объема коррелирует с течением времени изменения osmolaпасности камеры перфузии среды, используя кривую процедуру подгонки написанный на Matlab ('PfFit'), чтобы получить Рр.
Introduction
Поглощение воды и поток через клеточные мембраны является фундаментальным требованием для существования растений на клеточном и целых уровней растений. На клеточном уровне, аквапорины (AQPs) играют ключевую роль в регуляции осмотического коэффициента проницаемости воды (Р е) клеточной мембраны 1-3.
На сегодняшний день, несколько методов были использованы при измерении эндогенного Рр протопластовой из разных органов растений (т.е. корни, мезофилл, эндодерме, и т.д.., Отзывы на Шомон и др. 4). Один из подходов для измерения Рр является разоблачить протопластов в осмотического вызов и контролировать начальную скорость изменения объема (т.е.., Наклон начале линейной фазы изменения объема). Два различных метода были описаны ранее на основе этого подхода, как на основе мгновенного обмена решений. Первый состоит из immobilizчисле протопласта с всасывающим микропипетки и переключение поток раствора 5 и вторую передачи протопласта из одного раствора в другой с помощью микропипетки 6. Эти всасывающие микропипетка и микропипетка методы передача, которые позволяют захвата изображений в самом начале быстрого обмена раствора (захватить раннее линейную фазу изменения объема), вероятно, будут связаны физический стресс к протопластов и требуют специального оборудования и экспертных микроманипуляция.
Метод, описанный здесь минимизирует помехи для клеток, не влечет за микроманипуляция и позволяет вывод P F, когда ванна перфузии не мгновенно.
После ферментативного расщепления, протопласты, погруженные в изотоническом растворе, иммобилизуют на покровное стекло нижней части пластика (иначе Lucite или плексигласа) камеры путем взаимодействия заряда. Затем, в ходе постоянным ванны перфузии,изотонический раствор смывается с помощью гипотонического раствора, генерирующего гипоосмотическими вызов протопластов. Отек протопласта является видеозаписи, а затем, путем объединения информации о времени ход ванны перфузии и времени ход клеточного отека, P F определяется обработки изображений и аппроксимации кривой процедур.
Преимущества этого метода является то, что этот эксперимент не очень эффективным, т.е. можно контролировать несколько клеток одновременно в одном анализе, и что он не требует специального оборудования или особых навыков микроманипуляция. Несколько приложений для этого метода возможны. Например, определение родной P F разнообразных клетках из различных тканей и растений, таких как мезофилла и обкладки сосудисто-клеток из Arabidopsis листа 7, кукурузный мезофилла листа или корневых клетках коры 8-10 или суспензионных культурах клеток 11,12. В дополнительна, можно определить P F сферических клеток животных, таких как клетки ооцитов 11. Другой пример включает экспертизу AQP деятельности по временной экспрессии их генов в протопластов (или любых других генов, которые могут повлиять на них, например: гены киназ) и определение их вклада в P F; Например, экспрессия томатного AQP SlTIP2, 2 Arabidopsis в мезофильных протопластов путем трансформации ПЭГ и определения SlTIP2, 2, связанных с P F 13. Наконец, исследование влияния на P F различных молекул / веществ (наркотики, гормонов и т.д.) добавлен в растворах также могут быть рассмотрены, например в AQP блокатора HgCl 2 7.
Следующий протокол описывает выделение протопластов Arabidopsis мезофильных клетках и определение их P F.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь является простым и очень эффективная процедура для измерения Рр изолированных протопластов растений, применимые в принципе и к другим сферических ячеек, например., Лягушка ооцитов 11. Этот метод основан на измерении Рр в ответ на осмотическое вызо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального фонда бельгийской для Научным гр исследований (FNRS), Межвузовский достопримечательности поляки Программа-бельгийской научной политики и "Русская община Бельгийского-действия де RECHERCHES Concertées" в ФК, от Израиля научного фонда Иерусалиме ( ISF) ММ (грант № 1311/12), и в Нью-Мексико (грант № 1312/12).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
