SILAC иммунопреципитации эксперименты представляют собой мощное средство для обнаружения новый белок: белковых взаимодействий. Допуская точное относительное количественное определение белка изобилии в контрольной группе и тестовых образцов, истинных взаимодействий может быть легко отличить от экспериментальных загрязняющих веществ и низкой аффинности взаимодействия сохраняется за счет использования менее жестких условиях буфера.
Количественные протеомика в сочетании с очистки иммуно-аффинной, SILAC иммунопреципитацией, представляют собой мощное средство для открытия нового белка: белковых взаимодействий. Допуская точную количественную оценку относительного белка изобилии в контрольной группе и образцов, истинные взаимодействия могут быть легко отличить от экспериментальных загрязнений. Низким сродством взаимодействия могут быть сохранены путем использования менее жестких условиях буферных и быть легко идентифицировать. Этот протокол обсуждает маркировки клетках тканевой культуры с стабильный изотоп меченых аминокислот, трансфекции и иммунопреципитации сродством отмеченных интерес белок, после чего готовится для представления к массовому объекта спектрометрии. Этот протокол, то обсуждается, как анализировать и интерпретировать данные, возвращенные из масс-спектрометра с целью выявления клеточных партнеров, взаимодействующих с белком интересов. В качестве примера этот метод применяется для идентифы белки обязательные для эукариотических факторов инициации трансляции: eIF4AI и eIF4AII.
Существенным шагом в понимании функции белка является выявление соответствующих взаимодействующих белков. Где такие белки неизвестны есть ряд методов доступны, каждый со своими достоинствами и недостатками. К ним относятся дрожжи двух гибридную систему, раскрывающиеся анализов с использованием рекомбинантного белка, а также очистку тандем сродства или TAP-тегов 1, 2.
Более недавнее дополнение к этих методов является сочетание аффинной очистки интересующего белка от соответствующей линии клеток млекопитающих, а затем количественного масс-спектрометрии с использованием изотопа стабильного маркировки аминокислот в клеточной культуре (SILAC) 3. Это имеет преимущества по сравнению с дрожжевой двухгибридной подхода в этой локализации клеток и пост-трансляционных модификаций не возмущается, а также преимуществ по сравнению с традиционным TAP-тегов в том, что это количественное, а не качественное подход, позволяющий пользователю РиDíly отличить неспецифически взаимодействующих белков и загрязнителей, от хозяина факторов, которые специфически связываются. Кроме того, как образец анализировали обычно целом, а не в виде отдельных белковых полос, белки, представляющие интерес, не маскируется аналогично миграции белки в геле, и они, как правило, должны присутствовать в достаточном уровне, чтобы быть видимыми после окрашивания, что приводит к увеличение числа уверенно идентифицированных белков 4.
Чтобы продемонстрировать эту технику, GFP слитые тесно связанной с эукариотической фактор инициации трансляции eIF4AI и eIF4AII, что доля более 90% идентичности аминокислотной были исследованы SILAC-иммунопреципитации количественных протеомики. Человека eIF4AI и II, были клонированы в pEGFP-C1 сформировать гибридный белок, где GFP закрепляется на N-конце eIF4A. Чтобы избежать необходимости создания стабильных клеточных линий временная трансфекция был использован для доставки этих конструкций в стабильный изотоп меченых клеток 293Т.
<p class="Jove_content"> Клетки сначала помечены течение двух недель в SILAC клеточной культуральной среде, а затем трансфекции плазмидной ДНК, кодирующей интересующий белок. Клетки затем лизируют, концентрация белка нормализованы, и равное количество лизата сродством очищают на анти-GFP агарозы. Равные количества элюата, затем были объединены и представлены для анализа LC-MS/MS. Результаты этого анализа затем обрабатываются для выявления высокого доверия белок: белковые взаимодействия (рис. 1).SILAC иммунопреципитацию позволяет выявить не только прямых взаимодействий, но и низким сродством или косвенных взаимодействий с белковыми комплексами 4. Используя эту систему, eIF4AI и II immunoprecipitations разрешено воспроизводимый и уверенный опознавание первичной связывающим партнером eIF4G (изоформ I / II и III) 5, а также косвенные взаимодействия с eIF4E, а также многочисленные компоненты комплекса eIF3.
Стратегия пулдаун SILAC описано здесь представляет собой очень чувствительные и мощные средства обнаружения новый белок: белковых взаимодействий, и, кроме того позволяет быстро и просто дискриминация измененных обязательных моделей между тесно связанных образцов, представляющих интерес. В этом примере этот метод был использован для исследования белок: белок взаимодействий eIF4AI и eIF4AII белков 6. Насколько известно автору, это первое исследование, в литературе эксплуататорского полезность SILAC протеомики исследовать клеточный интерактома этих двух изоформ eIF4A.
Подход, как описано выше использует GFP-тегов и анти-GFP бусы 9, 10 и, следовательно, изменения могут потребоваться, с тем чтобы этот подход, который будет использоваться для конкретного интересующего белка, например, является ли тег помещается в N-или С-конец белка. Где это возможно, западные пятна или функциональные тесты должныбыть выполнены, чтобы обнаружить связывание известного партнера белка взаимодействия. Если белок не переносят слияние с GFP тега, другой маркировкой или выпадающих стратегий были применены к SILAC Pulldowns использованием как другие метки (FLAG 11, биотин 12, STREP (собственные данные, не опубликовано)), или с помощью первичных антител против белка интереса, где миРНК нокдаун белка-мишени обеспечивает контрольный образец 13. Такие эксперименты были описаны в другом месте в литературе, но вкратце, шаг 1 и шаги 5.4-8 будет применяться, как указано выше, с шагами 2-5.3 модифицированных в случае необходимости для экспрессии / выпадающего системы выбора с использованием равных входных белка, как описано в шаги 2.4-2.5. Как этапы количественного позволяют неспецифического связывания белков должны быть удалены на уровне анализа, рекомендуется опустить преинкубации с контрольными бисером, или высоких моет соли для того, чтобы сохранить низким сродством белок: белковые взаимодействия с интересующего белка . Нуклеазы мау быть включены или исключены из этого протокола в соответствии со спецификой конкретного эксперимента. Например: как белки, используемые в этом методе являются РНК геликазы, РНКазы коктейль был включен в протокол, чтобы удалить косвенного взаимодействия, опосредованные через РНК (шаг 3.2). Однако в некоторых случаях, не может быть выгоду от запуска параллельных экспериментов с и без нуклеазы определить нуклеиновых кислот зависимые взаимодействия.
В рамках этого протокола, переключение "среды" и "тяжелых" образцов в повторных экспериментах рекомендуется контролировать для изменения введенной различий в SILAC СМИ или рост клеток. Альтернативный контроль включает в себя последовательное переключение всех трех («легкие», «среднего» и «тяжелый») СМИ в реплик экспериментов. В то время как этот подход является потенциально более строгими, это увеличить сложность анализа, как минимум в одной репликации, представляющего интерес белка шплохо быть произведены в «свет» меченых клеток и поэтому необходимо различать белков последовательно, определенных в «свет» образцов (загрязнители окружающей среды, такие как кератинами), и те, которые обогащены только в «свет» образцов при связывании с белком интерес.
В то время как использование количественного данных позволяет различение конкретных-от неспецифических взаимодействий за счет использования порогового значения, неизбежно некоторые подлинные взаимодействия могут быть отброшены. Подход выше простой и быстрый подход к идентификации белков: белковых взаимодействий, которые могут быть легко попытки исследователей без предыдущего опыта с масс-спектрометрии, или анализа большого белка: наборы данных белковых взаимодействий. Для большинства применений этого более чем достаточно для идентификации новых белков, представляющих интерес. Дальнейшие модификации данного подхода, чтобы помочь уменьшить эту потерю данных описаны в другом месте в литературе и включают использование пр.otein библиотека частота где известно примесей белков для конкретного набора параметров эксперимента (клеточной линии борта матрицы, условий буфер) могут быть исключены 10, 14. Тем не менее, в зависимости от конкретных экспериментальных параметров может быть необходимо, чтобы запустить ряд контрольных экспериментов, чтобы генерировать шарик протеом и, следовательно, это может увеличить как расходы и сложность эксперимента. Дополнительная информация об этой технике можно получить в www.peptracker.co.uk сайте 14.
Следует также отметить, что протокол, описанный выше включает смешивание по-разному меченых проб в конце процесса иммунопреципитации (называется смесительной после очистки – MAP SILAC эксперимента). Это делается белка: белковые взаимодействия происходить при заданной равновесия 15. Следует отметить, что другие группы объединили Эта карта SILAC подход, описанный в данном протоколе с инкубации образцовдо пулдауна (очистка после смешивания – PAM SILAC) для различных отрезков времени (20 мин до 2 ч, были использованы в литературе) 15, 16. На основе того, насколько быстро падает соотношение белок к 1:1, то можно качественно исследовать аффинности связывания и для определения белков в качестве стабильных или динамических взаимодействующих белков 15.
Таким образом, SILAC Pulldowns представляют собой очень мощные средства идентификации белков, взаимодействующих с данной интерес белка, в физиологически соответствующего обстановке. Этот метод может быть очень легко адаптировать к ряду различных стратегий очистки, что позволяет его применение к той или иной интерес белка. Количественное определение результатов значительно упрощает идентификацию подлинных взаимодействий и позволяет релаксацию жестких условиях буфер, используемый для удаления неспецифических связующих и, следовательно, сохраняет низкие взаимодействия сродством. Как до трех образцов можно сравнить в приведенном вышеСтратегия, техника имеет четкие преимущества в сравнении различия в Связывание белков между различными белковых изоформ, мутантных белков, или эффекта фармакологических ингибиторов. Как целые кусочки геля анализируются, а не отдельных групп, которые пятно Кумасси, количество белков, выявленных на высокое доверие, как правило, выше, чем те, которые определены в стандартном GST / TAP-пулдауна, и экспериментатор предвзятость в выборе белки интересов удаляется. Техника поэтому сравнивает очень выгодно отличается от других широко используемых методов, используемых в идентификации новых белков-взаимодействий (дрожжи 2-гибридных, GST / Его или TAP Pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Wellcome Trust и BBSRC в ИГ. И.Г. является Wellcome старший научный сотрудник.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |